1、 生化材料
鸡胰腺粉(冻干)
椰子油
腰果酚A
腰果酚B
生物质腰果酚磺酸盐表面活性剂
2、 特种树脂
红外增感树脂
耐溶剂型成膜树脂
热敏相转变树脂
KFP系列树脂
3、 响应型单体
2,4,6-三己氧基重氮苯5-苯甲酰基-4-羟基-2-甲氧基苯磺酸盐
红外增感染料
N-异丙基丙烯酰胺
4-磺酰苯基丙烯酰胺
N,N'-(1,4-亚苯基)双马来酰亚胺(对苯基双马来酰亚胺)
N-对羟苯基丙烯酰胺(AHPAA)
2-氯-1-甲酰-3-羟基亚甲基环己烯
1,1,2-三甲基苯并[e]吲哚
4、手性化合物
5、QINP1系列潜伏性环氧树脂固化剂
6、石材防水背胶(背网专用)
 
 
 
 

大鼠牙周膜I型胶原mRNA原位杂交方法的建立

刘 飞 赵云凤 李明哲
  牙周膜(PeriodontalLigament,PDL)是牙周组织的主要结构之一,其中胶原又是PDL的主要成份。牙周胶原在牙周改建中起着要作用。PDL中有 I 、III 、V 、VI 、VII、VIII 型胶原,其中I型胶原最多,占胶原量的85%〔1,2〕。可以说牙周膜的改建在很大程度上取决于 型胶原的改建。 型胶原给PDL提供抗张强度,使牙齿能承受咀嚼压力。已有学者用免疫组化法定位了 型胶原在PDL中的表达〔3〕。20世纪90年代,学者们开始用分子生物学的手段来研究牙周胶原的代谢,所涉及的方法有原位杂交(InSituHybridization,ISH),RNA转移斑点法等〔4.5,6〕。其中最常见的是原位杂交。ISH是将组织化学与分子生物学技术相结合用以检测和定位核酸的技术。它利用了核酸分子的碱基互补配对性,用一标记的核酸探针去检测与之很高,可以在基因水平和转录水平进行检测。
  用ISH法可以在转录水平特异性地检测各种生理及病理情况下牙周膜内 型胶原mRNA表达的变化情况,为牙周膜的相关研究提供了一种有效、可靠的检测方法,但目前国内尚未见关于用原位杂交(ISH)法检测牙周膜内I型胶原mRNA表达的报道。本实验以雄性Wistar大鼠为对象,建立了检测大鼠牙周膜内I型胶原mRNA表达的原位杂交方法,其基本步骤也适用于其它种属的动物及其它mRNA。
材料与方法
1. 标本制备
    选用80只体重为250±20g的雄性Wistar成年大鼠,给大鼠注射过量麻药后,左心室用4%多聚甲醛灌注。解剖出下颌骨,仅保留磨牙区骨段,浸泡于4%多聚甲醛中再固定6小时。将标本移入脱钙液(含0.7g/LEDTA,8mg/L酒石酸钠钾,0.14g/L酒石酸钠,99.2ml/LHCL)中4℃保存两周。洗净脱钙液,梯度乙醇脱水,石蜡包埋。每个下颌骨标本切3张组织切片,厚度一律控制为5μm,裱于经硅化处理的玻片上。
2. 探针的制备与标记
   采用长度为39个碱基的反意义寡核苷酸探针,序列为:s-1-GCC GTC TTC AGA GCT GTA AAC GTG GAG GCA AGG AGT CCC-3-1。用地高辛寡核苷酸加尾试剂盒将地高辛精11-dUTP标记到寡核苷酸的3’末端。
3. 原位杂交
   常规二甲苯脱蜡,梯度酒精至水(Depc水);0.2MHC1中浸泡20分钟,Depc水洗;加入50μg/ml蛋白酶K,37℃孵育20分钟,PBS洗;0.2%甘氨酸PBS溶液浸泡20分钟,PBS洗;4%多聚甲醛的PBS溶液后固定20分钟,PBS洗;0.25%乙酸酐、0.1M三乙醇胺溶液浸泡10分钟,PBS洗;酒精梯度脱水,空气中干燥1小时;准备杂交缓冲液:0.125mg/mlSSDNA、0.25mg/mltRNA、50%甲酰胺、12.5%硫酸葡聚糖,104℃干浴10分钟后自然冷却到室温,再加入适量DTT,备用;将标记好的探针用探针稀释液配至10μg/ml,再与杂交缓冲液以1∶5的比例混匀成杂交液;滴加预杂交液,42℃孵育2小时;倾去预杂交液,滴加杂交液,加盖玻片,42℃孵育16小时。
4. 杂交信号的检测
   将玻片移到预热到37℃的甲酰胺溶液中摇动浸洗5分钟,至盖玻片脱落;用2×SSC在37℃水浴中振动清洗两次(15分钟及30分钟);用0.2×SSC在47℃水浴中振动清洗两次(15分钟及30分钟)1×马来酸缓冲液洗10分钟,室温;滴加阻断剂,30分钟,室温;滴加新鲜配制的1∶1000抗地高辛碱性磷酸酶,37℃中孵育3小时;马来酸缓冲液洗后滴加检测缓冲液;滴加1∶50的NBT/BCIP,25℃避光显色13小时,自来水冲洗;2%甲基绿复染;切片干燥,二甲苯透明,加拿大胶封片。
5. 对照实验
   为了验证原位杂交实验操作的准确性以及结果的特异性,需要设置包括探针、杂交反应和检测系统对照在内的一系列阳性对照和阴性对照。
5.1 探针对照:包括用大鼠皮肤标本进行原位杂交和用等长正意义链探针做原位杂交。
5.2 杂交反应对照:包括省去标记探针杂交、用未标记探针杂交及用RNA酶处理标本后杂交。
5.3 检测系统对照:检测时省去滴加Anti-Dig-AP步骤。
结  果
1. 对照实验为了证实所用探针的敏感性,用有活跃 型胶原mRNA表达的大鼠皮肤标本进行原位杂交,得到了理想的阳性结果(图1);各阴性对照均未检测到信号(图2)。


  2. 蛋白酶K(ProteinaseK,PK)浓度
    PK浓度在1μg/ml至50μg/ml范围时,标本的信号随着PK浓度的升高而升高(温度均为37℃,孵育时间均为20分钟)。当PK浓度为100μg/ml时,信号强度不再上升(表1)

  3. 大鼠PDL 型胶原mRNA的表达
    大鼠PDL 型胶原mRNA的表达很强。这种强的表达在PDL的骨侧、牙侧和中间区的分布体上是均匀的,根的近中侧PDL紧靠骨壁的成骨细胞有很强的信号(图3)。
讨  论
1.蛋白酶K的浓度对杂交信号强度的影响
   蛋白酶消化能使经固定后被遮蔽的靶核酸暴露,以增加靶核酸的可及性。蛋白酶的浓度及孵育时间视组织种类、固定剂类型、切片厚度等而定。过度的蛋白酶消化会引起细胞形态结构的破坏及靶核酸的减少,也会导致标本从载片上脱落〔7〕。本实验采用了PK消化法,经过反复摸索,发现当PK浓度为50μg/ml,孵育时间为20min,温度为37℃时可以达到最佳效果(表1)。而日本学者Masahiro(1994)在研究大鼠磨牙牙周膜 型胶原mRNA表达时采用的PK浓度为1μg/ml,孵育时间为37℃,时间为15分钟〔8〕。美国学者Karimbux(1995)采用的PK浓度为20μg/ml,22℃,10分钟〔5〕。这同本实验的50μg/ml相比有较大差距。可能是由于切片类型和操作手法不同所致。比如Masahiro采用的是冰冻切片。冰冻标本省去了石蜡包埋的步骤,靶核酸更易充分暴露,并且他所采用的切片厚度(10μ)远大于本实验(5μ),故所需PK浓度大大降低。Karimbux虽然也是采用石蜡切片,但所用PK量大,是将切片整个浸泡于PK中,而本实验是采用滴加法,每张切片仅加80μl。前述两学者所得PDL 型胶原mRNA信号均弱于本实验。本实验观察到当PK浓度低于50μg/ml时仍可检测到信号,但较弱,PK浓度为10μg/ml时信号强度与Karimbux实验相似。随着PK浓度的提高,信号加强。说明用原位杂交法检测PDL 型胶原mPNA时需较高的PK浓度,以充分暴露靶核酸。本实验摸索到的50μg/ml浓度可达到理想效果。
2. 杂交敏感性
   控制所谓敏感性是指用该方法能检测到存在的靶核酸。前述的适宜浓度PK处理即为增加敏感性的一个方面。本实验的敏感性很高,在待测组中检测到了高水平的靶核苷酸表达,并且在阳性对照组织(皮肤)中也得到了很强的信号。归纳起来,本实验良好的敏感性是因采用以下措施:
2.1切实做好防止RNA酶污染。防止RNA酶污染是ISH成功的关键。
2.2采取有力措施增强组织的通透性及核酸探针的穿透性。本实验摸索到了适于PDL组织的适宜PK处理条件,使靶mRNA得以充分暴露。另外杂交前还采用了0.2MHCL处理20分钟,稀酸能使组织中的碱性蛋白变性,结合PK消化,易将碱性蛋白移除,这样就增加了靶mRNA的可及性。
2.3适宜的探针和较佳的标记方法。本实验采用39个碱基的寡核苷酸探针,长度短,易进入细胞,杂交率高;本实验采用加尾标记法,通过末端转移酶将数个地高辛标记的dUTP加在探针3’末端,使信号更易被检测。
2.4合适的抗地高辛碱性磷酸酶孵育时间及显色时间。为了增强敏感性,本实验中抗地高辛抗体的孵育时间较长,为3h,显色时间也较长,为14h。同免疫组化法类似,适当延长抗体孵育时间及显色时间有助于增强信号。但显色时间过长会造成背景加深,使结果的特异性减弱,本实验在摸索阶段时对显色时间与信号强度的关系进行了反复实验,最后采用了14h,因为此时不但信号很强,而且切片的背景较佳。
3. 杂交特异性控制
   为了增强杂交的特异性,本实验采取了如下措施:
3.1杂交前用乙酸酐和稀酸处理。经乙酸酐处理后,组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断,这样就可以防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合,减少非特异性染色,本实验也用0.2MHCL处理切片,稀酸能使碱性蛋白变性,结合PK消化,易将之移除,这样也可避免碱性蛋白与探针之间的非特异性结合。
3.2预杂交可阻断载玻片和组织标本中可能与探针产生非特异性结合的位点。
3.3高严格度条件下进行杂交后洗涤。为了保证能将合不相配碱其对的杂交体充分洗去,减低背景,增加信/噪比,本实验杂交后在恒温振荡器内进行了从高浓度到低浓度,从低温到高温的充分洗涤。
3.4采用特异性序列的寡核苷酸探针。该探针与编码大鼠 型胶原α1(I)链N-前肽的特异性区域mRAN互补。该序列与基因库中其它核苷酸序列无明显相同之处。
3.5为了检测本实验的特异性,还设置了一系列的阴性实验,均得到了阴性结果。

 
 
 
   
 
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