1、 生化材料
鸡胰腺粉(冻干)
椰子油
腰果酚A
腰果酚B
生物质腰果酚磺酸盐表面活性剂
2、 特种树脂
红外增感树脂
耐溶剂型成膜树脂
热敏相转变树脂
KFP系列树脂
3、 响应型单体
2,4,6-三己氧基重氮苯5-苯甲酰基-4-羟基-2-甲氧基苯磺酸盐
红外增感染料
N-异丙基丙烯酰胺
4-磺酰苯基丙烯酰胺
N,N'-(1,4-亚苯基)双马来酰亚胺(对苯基双马来酰亚胺)
N-对羟苯基丙烯酰胺(AHPAA)
2-氯-1-甲酰-3-羟基亚甲基环己烯
1,1,2-三甲基苯并[e]吲哚
4、手性化合物
5、QINP1系列潜伏性环氧树脂固化剂
6、石材防水背胶(背网专用)
 
 
 
 

内皮素 1诱导培养的人肺动脉平滑肌细胞I、Ⅲ型胶原蛋白及其mRNA表达

孟国伟1,郭兰敏2,劳 萍3,邹承伟2,王安彪2
(1 山东大学第二医院心外科,济南250033;山东省立医院2 心外科;3 中心实验室,济南250021)
  胶原是细胞外间质的主要成分,可由成纤维细胞、某些上皮细胞、心肌细胞和平滑肌细胞等合成并分泌到细胞外。大量研究结果表明,胶原与肺动脉高压的形成密切相关。胶原等细胞外间质在肺血管壁增生、沉积,导致肺血管壁增厚、管腔狭窄是肺动脉高压形成过程中主要的病理生理学改变之一[1,2]。然而胶原增生的原因尚不清楚。近年来研究发现肺动脉高压病人血浆内皮素 1(ET 1)水平升高[3],提示ET 1可能参与了肺动脉高压的形成过程,但ET 1对体外培养的人肺动脉平滑肌细胞(HPASMC)胶原合成的影响及其在肺动脉高压形成中的作用尚未见报道。
1 材料和方法
1 .1 材料
    含人I型和Ⅲ型前胶原探针的质粒pHCAL1U和pHFS3为芬兰Turku大学EeroVuorio教授惠赠。其重组情况如下:⑴pHCAL1U含有670bp的人I型前胶原α1(I)cDNAXhoI EcoRI片段,克隆在pUC8质粒SaⅡ和EcoRI位点,用PvuⅡ Pst1双酶切得到的372bp片段作为I型胶原的探针。⑵pHFS3含有705bp人Ⅲ型前胶原α1(Ⅲ)cDNAXhoI EcoRI片段,克隆在质粒pUC8SaⅡ和EcoRI位点。用PstI PstI酶切所得的295bp的片段作为Ⅲ型胶原的探针。⑶作为探针阳性对照的pBR322质粒酶切片段是地高辛标记试剂盒中试剂。培养基RPMI1640、胰蛋白酶、HEPES为GIBCO公司产品,ET 1、小鼠抗人α SM ac tin单克隆抗体为sigma公司产品,兔抗人I、Ⅲ型胶原抗体购自武汉博士德公司。地高辛高效标记及检测试剂盒为BoehringerMannheim(Biochemical)公司产品。小牛血清购自山东省医学科学院。其他工具酶及生化试剂为Sigma公司产品。
1 .2 PASMC的培养
1 .2. 1 HPASMC的分离、培养:取事故流产后死亡的7个月胎儿,无菌操作剪取胎儿主肺动脉及左、右肺动脉,Hanks液冲洗3次,参照Ross介绍的贴块培养法剥除血管内、外膜[4]。取血管中层组织剪成1mm3大小组织块,均匀贴种于预先用小牛血清涂层的50mL培养瓶中,翻转培养瓶放入37℃,5%CO2孵箱中贴壁2~4h,正置培养瓶,加入含20%小牛血清的RPMI1640培养液继续培养,待细胞长满后消化传代,实验取3~9代细胞。
1. 2 .2 HPASMC的鉴定:根据细胞形态、生长特点、超微结构、平滑肌α肌动蛋白免疫检测结果鉴定人肺动脉平滑肌细胞。
1. 3 ET 1对原代培养的HPASMCI、Ⅲ型胶原蛋白合成的影响
    将培养的HPASMC接种在盖玻片上,密度为5×104 mL,先加入含10%小牛血清的RPMI1640培养液培养24h,然后更换为含1%小牛血清的RP MI1640培养液再培养24h,使细胞同步化。实验组(n=6)加入10-8mol LET 1,对照组(n=6)不加ET 1,继续培养72h,取出盖玻片,4%甲醛固定20~30min,采用SABC试剂盒,DAB显色剂作免疫细胞化学染色,一抗为兔抗人I、Ⅲ型胶原多克隆抗体(1∶400)。
1 .4 ET 1对原代培养的HPASMCI、Ⅲ型前胶原mRNA表达的影响
1. 4 .1 探针制备:按报道的方法进行重组质粒抗性分析,选取单菌落进行重组质粒小量扩增,限制性内切酶图谱分析,最后大量扩增提取质粒,用PvuⅡ Pst1双酶切得到的372bp片段作为I型胶原的探针,用Pst1 Pst1酶切所得的295bp的片段作为Ⅲ型胶原的探针。酶切后用PEG8000回收目的cDNA片段,采用地高辛高效标记及检测试剂盒标记cDNA探针。
1. 4 .2 培养细胞的原位杂交:将培养的HPASMC接种在盖玻片上,密度为5×104 mL,细胞培养及同步化方法同免疫细胞化学染色。实验组(n=6)加入10-8mol LET 1,对照组(n=6)不加ET 1,培养48h后取出盖玻片,4%多聚甲醛固定30min,经0 2mol LHCl作用10min,0 2%TribonX 100作用15min,0 2%甘氨酸作用15min,蛋白酶K(lmg L)37℃消化20min,4%多聚甲醛后固定15min,梯度乙醇脱水,滴加预杂交液,42℃孵育30min~2h,加杂交液(探针浓度2mg L)42℃杂交12~18h,冲洗后加抗地高辛抗体(1∶5000)2h,NBT BCIP显色液显色。
1. 5 图像分析
   应用MPIAS 500自动图像分析仪对免疫细胞化学染色和原位杂交细胞片进行图像分析,测定细胞平均光密度。
1. 6 统计方法
   所有数据均以平均数x—±s标准差表示,两组数据间比较用t检验。
2 结果
2 .1 HPASMC的培养、鉴定
   倒置相差显微镜下观察培养的HPASMC,细胞融合时呈长梭形,重叠生长,呈典型的“谷、峰”状;单个细胞则可呈多边形,较宽大。小鼠抗人α SM actin单克隆抗体免疫细胞化学染色显示培养的HPASMC胞浆内有染成棕黄色的丝状物,与细胞长轴平行(α SM actin)。电镜下观察培养的HPASMC,胞浆内可见肌丝束。
2 .2 ET 1对培养的HPASMCI、Ⅲ型胶原蛋白合成的影响
   用兔抗人I、Ⅲ型胶原多克隆抗体检测培养的HPASMCI、Ⅲ型胶原蛋白合成的情况,结果显示实验组I、Ⅲ型胶原蛋白表达明显强于对照组(P<0 01)(图1,表1)。



2. 3 ET 1对培养的HPASMCI、Ⅲ型胶原mRNA表达的影响
    应用地高辛标记的人I、Ⅲ型前胶原cDNA探针,通过原位杂交检测体外培养的HPASMCI、Ⅲ型前胶原mRNA的表达,结果显示实验组I、Ⅲ型胶原mRNA表达明显强于对照组(P<0 01)(图2,表1)。

3 讨论
   胶原是细胞外间质的主要成分,胶原在肺血管壁增生、沉积导致肺血管壁增厚、管腔狭窄是肺动脉高压持续存在并难以治疗的主要原因,但胶原增生的确切原因尚不清楚。1995年,Mansoor等在体外培养的兔肺动脉平滑肌细胞培养液中加入不同浓度的ET 1,用SDS PAGE方法测定平滑肌细胞分泌的I、Ⅲ、V型胶原的相对含量,结果发现V型胶原含量明显增加[5]。我们的实验以培养的人肺动脉平滑肌细胞为研究对象,就ET 1对人肺动脉平滑肌细胞胶原合成的影响进行了更加深入的探讨。我们在以前的试验中曾发现,ET 1能够使培养的HPASMC胶原合成增加,且10-8mol LET 1作用最强。因此我们在本实验中观察了10-8mol LET 1对HPASMCI、Ⅲ型胶原蛋白及其mRNA表达的影响。在免疫组化实验中,发现10-8mol LET 1能够明显增强HPASMCI、Ⅲ型胶原蛋白的表达。与Mansoor的报道不完全一致。出现上述差别的原因可能是由于细胞种属和检测方法不同。不同胶原在结构上具有一定的同源性,表现为结构组成上均为长的不间断的胶原螺旋三聚体,I型胶原是由两个α1(I)和一个α2(I)组成的三聚体,三条α链分别由两个不同的基因proα1(I)、proα2(Ⅱ)编码,可以用proα1(I)mRNA水平来反映I型基因表达的情况。Ⅲ型胶原则是α1(Ⅲ)的同源三聚体,由一个基因proα1(Ⅲ)编码,可以用proα1(Ⅲ)mRNA水平来反映Ⅲ型基因表达的情况。
    我们选择敏感性很高的原位杂交方法,用地高辛标记的人I、Ⅲ型前胶原cDNA探针对HPASMCI、Ⅲ型前胶原mRNA进行检测,按E Vurio提供的方法选择探针,I、Ⅲ型前胶原cDNA探针之间同源性很小[6],结果显示10-8mol LET 1可明显增强培养的HPASMCI、Ⅲ型前胶原mRNA的表达,与蛋白质水平的检测是一致的。上述研究结果说明,ET 1是在基因转录水平上通过增强I、Ⅲ型前胶原mRNA的表达而增加胶原合成的。已经证实平滑肌细胞分布有ET 1受体,ET 1是通过与特异的内皮素受体结合而发挥效应。但ET 1在细胞内是如何完成信息传递并调控I、Ⅲ型胶原的合成和分泌,还有待进一步研究。

 
 
 
   
 
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