孟国伟1,郭兰敏2,劳　萍3,邹承伟2,王安彪2
(1 山东大学第二医院心外科,济南250033;山东省立医院2 心外科;3 中心实验室,济南250021)
　　胶原是细胞外间质的主要成分,可由成纤维细胞、某些上皮细胞、心肌细胞和平滑肌细胞等合成并分泌到细胞外。大量研究结果表明,胶原与肺动脉高压的形成密切相关。胶原等细胞外间质在肺血管壁增生、沉积,导致肺血管壁增厚、管腔狭窄是肺动脉高压形成过程中主要的病理生理学改变之一[1,2]。然而胶原增生的原因尚不清楚。近年来研究发现肺动脉高压病人血浆内皮素 1(ＥＴ 1)水平升高[3],提示ＥＴ 1可能参与了肺动脉高压的形成过程,但ＥＴ 1对体外培养的人肺动脉平滑肌细胞(ＨＰＡＳＭＣ)胶原合成的影响及其在肺动脉高压形成中的作用尚未见报道。
1　材料和方法
1 .1　材料
    含人Ｉ型和Ⅲ型前胶原探针的质粒ｐＨＣＡＬ1Ｕ和ｐＨＦＳ3为芬兰Ｔｕｒｋｕ大学ＥｅｒｏＶｕｏｒｉｏ教授惠赠。其重组情况如下:⑴ｐＨＣＡＬ1Ｕ含有670ｂｐ的人Ｉ型前胶原α1(Ｉ)ｃＤＮＡＸｈｏＩ ＥｃｏＲＩ片段,克隆在ｐＵＣ8质粒ＳａⅡ和ＥｃｏＲＩ位点,用ＰｖｕⅡ Ｐｓｔ1双酶切得到的372ｂｐ片段作为Ｉ型胶原的探针。⑵ｐＨＦＳ3含有705ｂｐ人Ⅲ型前胶原α1(Ⅲ)ｃＤＮＡＸｈｏＩ ＥｃｏＲＩ片段,克隆在质粒ｐＵＣ8ＳａⅡ和ＥｃｏＲＩ位点。用ＰｓｔＩ ＰｓｔＩ酶切所得的295ｂｐ的片段作为Ⅲ型胶原的探针。⑶作为探针阳性对照的ｐＢＲ322质粒酶切片段是地高辛标记试剂盒中试剂。培养基ＲＰＭＩ1640、胰蛋白酶、ＨＥＰＥＳ为ＧＩＢＣＯ公司产品,ＥＴ 1、小鼠抗人α ＳＭ ａｃ ｔｉｎ单克隆抗体为ｓｉｇｍａ公司产品,兔抗人Ｉ、Ⅲ型胶原抗体购自武汉博士德公司。地高辛高效标记及检测试剂盒为ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ(Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ)公司产品。小牛血清购自山东省医学科学院。其他工具酶及生化试剂为Ｓｉｇｍａ公司产品。
1 .2　ＰＡＳＭＣ的培养
1 .2. 1　ＨＰＡＳＭＣ的分离、培养:取事故流产后死亡的7个月胎儿,无菌操作剪取胎儿主肺动脉及左、右肺动脉,Ｈａｎｋｓ液冲洗3次,参照Ｒｏｓｓ介绍的贴块培养法剥除血管内、外膜[4]。取血管中层组织剪成1ｍｍ3大小组织块,均匀贴种于预先用小牛血清涂层的50ｍＬ培养瓶中,翻转培养瓶放入37℃,5%ＣＯ2孵箱中贴壁2～4ｈ,正置培养瓶,加入含20%小牛血清的ＲＰＭＩ1640培养液继续培养,待细胞长满后消化传代,实验取3～9代细胞。
1. 2 .2　ＨＰＡＳＭＣ的鉴定:根据细胞形态、生长特点、超微结构、平滑肌α肌动蛋白免疫检测结果鉴定人肺动脉平滑肌细胞。
1. 3　ＥＴ 1对原代培养的ＨＰＡＳＭＣＩ、Ⅲ型胶原蛋白合成的影响
    将培养的ＨＰＡＳＭＣ接种在盖玻片上,密度为5×104 ｍＬ,先加入含10%小牛血清的ＲＰＭＩ1640培养液培养24ｈ,然后更换为含1%小牛血清的ＲＰ ＭＩ1640培养液再培养24ｈ,使细胞同步化。实验组(ｎ=6)加入10-8ｍｏｌ ＬＥＴ 1,对照组(ｎ=6)不加ＥＴ 1,继续培养72ｈ,取出盖玻片,4%甲醛固定20～30ｍｉｎ,采用ＳＡＢＣ试剂盒,ＤＡＢ显色剂作免疫细胞化学染色,一抗为兔抗人Ｉ、Ⅲ型胶原多克隆抗体(1∶400)。
1 .4　ＥＴ 1对原代培养的ＨＰＡＳＭＣＩ、Ⅲ型前胶原ｍＲＮＡ表达的影响
1. 4 .1　探针制备:按报道的方法进行重组质粒抗性分析,选取单菌落进行重组质粒小量扩增,限制性内切酶图谱分析,最后大量扩增提取质粒,用ＰｖｕⅡ Ｐｓｔ1双酶切得到的372ｂｐ片段作为Ｉ型胶原的探针,用Ｐｓｔ1 Ｐｓｔ1酶切所得的295ｂｐ的片段作为Ⅲ型胶原的探针。酶切后用ＰＥＧ8000回收目的ｃＤＮＡ片段,采用地高辛高效标记及检测试剂盒标记ｃＤＮＡ探针。
1. 4 .2　培养细胞的原位杂交:将培养的ＨＰＡＳＭＣ接种在盖玻片上,密度为5×104 ｍＬ,细胞培养及同步化方法同免疫细胞化学染色。实验组(ｎ=6)加入10-8ｍｏｌ ＬＥＴ 1,对照组(ｎ=6)不加ＥＴ 1,培养48ｈ后取出盖玻片,4%多聚甲醛固定30ｍｉｎ,经0 2ｍｏｌ ＬＨＣｌ作用10ｍｉｎ,0 2%ＴｒｉｂｏｎＸ 100作用15ｍｉｎ,0 2%甘氨酸作用15ｍｉｎ,蛋白酶Ｋ(ｌｍｇ Ｌ)37℃消化20ｍｉｎ,4%多聚甲醛后固定15ｍｉｎ,梯度乙醇脱水,滴加预杂交液,42℃孵育30ｍｉｎ～2ｈ,加杂交液(探针浓度2ｍｇ Ｌ)42℃杂交12～18ｈ,冲洗后加抗地高辛抗体(1∶5000)2ｈ,ＮＢＴ ＢＣＩＰ显色液显色。
1. 5　图像分析
   应用ＭＰＩＡＳ 500自动图像分析仪对免疫细胞化学染色和原位杂交细胞片进行图像分析,测定细胞平均光密度。
1. 6　统计方法
   所有数据均以平均数ｘ—±ｓ标准差表示,两组数据间比较用ｔ检验。
2　结果
2 .1　ＨＰＡＳＭＣ的培养、鉴定
   倒置相差显微镜下观察培养的ＨＰＡＳＭＣ,细胞融合时呈长梭形,重叠生长,呈典型的“谷、峰”状;单个细胞则可呈多边形,较宽大。小鼠抗人α ＳＭ ａｃｔｉｎ单克隆抗体免疫细胞化学染色显示培养的ＨＰＡＳＭＣ胞浆内有染成棕黄色的丝状物,与细胞长轴平行(α ＳＭ ａｃｔｉｎ)。电镜下观察培养的ＨＰＡＳＭＣ,胞浆内可见肌丝束。
2 .2　ＥＴ 1对培养的ＨＰＡＳＭＣＩ、Ⅲ型胶原蛋白合成的影响
   用兔抗人Ｉ、Ⅲ型胶原多克隆抗体检测培养的ＨＰＡＳＭＣＩ、Ⅲ型胶原蛋白合成的情况,结果显示实验组Ｉ、Ⅲ型胶原蛋白表达明显强于对照组(Ｐ<0 01)(图1,表1)。

3　讨论
   胶原是细胞外间质的主要成分,胶原在肺血管壁增生、沉积导致肺血管壁增厚、管腔狭窄是肺动脉高压持续存在并难以治疗的主要原因,但胶原增生的确切原因尚不清楚。1995年,Ｍａｎｓｏｏｒ等在体外培养的兔肺动脉平滑肌细胞培养液中加入不同浓度的ＥＴ 1,用ＳＤＳ ＰＡＧＥ方法测定平滑肌细胞分泌的Ｉ、Ⅲ、Ｖ型胶原的相对含量,结果发现Ｖ型胶原含量明显增加[5]。我们的实验以培养的人肺动脉平滑肌细胞为研究对象,就ＥＴ 1对人肺动脉平滑肌细胞胶原合成的影响进行了更加深入的探讨。我们在以前的试验中曾发现,ＥＴ 1能够使培养的ＨＰＡＳＭＣ胶原合成增加,且10-8ｍｏｌ ＬＥＴ 1作用最强。因此我们在本实验中观察了10-8ｍｏｌ ＬＥＴ 1对ＨＰＡＳＭＣＩ、Ⅲ型胶原蛋白及其ｍＲＮＡ表达的影响。在免疫组化实验中,发现10-8ｍｏｌ ＬＥＴ 1能够明显增强ＨＰＡＳＭＣＩ、Ⅲ型胶原蛋白的表达。与Ｍａｎｓｏｏｒ的报道不完全一致。出现上述差别的原因可能是由于细胞种属和检测方法不同。不同胶原在结构上具有一定的同源性,表现为结构组成上均为长的不间断的胶原螺旋三聚体,Ｉ型胶原是由两个α1(Ｉ)和一个α2(Ｉ)组成的三聚体,三条α链分别由两个不同的基因ｐｒｏα1(Ｉ)、ｐｒｏα2(Ⅱ)编码,可以用ｐｒｏα1(Ｉ)ｍＲＮＡ水平来反映Ｉ型基因表达的情况。Ⅲ型胶原则是α1(Ⅲ)的同源三聚体,由一个基因ｐｒｏα1(Ⅲ)编码,可以用ｐｒｏα1(Ⅲ)ｍＲＮＡ水平来反映Ⅲ型基因表达的情况。
    我们选择敏感性很高的原位杂交方法,用地高辛标记的人Ｉ、Ⅲ型前胶原ｃＤＮＡ探针对ＨＰＡＳＭＣＩ、Ⅲ型前胶原ｍＲＮＡ进行检测,按Ｅ Ｖｕｒｉｏ提供的方法选择探针,Ｉ、Ⅲ型前胶原ｃＤＮＡ探针之间同源性很小[6],结果显示10-8ｍｏｌ ＬＥＴ 1可明显增强培养的ＨＰＡＳＭＣＩ、Ⅲ型前胶原ｍＲＮＡ的表达,与蛋白质水平的检测是一致的。上述研究结果说明,ＥＴ 1是在基因转录水平上通过增强Ｉ、Ⅲ型前胶原ｍＲＮＡ的表达而增加胶原合成的。已经证实平滑肌细胞分布有ＥＴ 1受体,ＥＴ 1是通过与特异的内皮素受体结合而发挥效应。但ＥＴ 1在细胞内是如何完成信息传递并调控Ｉ、Ⅲ型胶原的合成和分泌,还有待进一步研究。