|
|
| |
| |
 |
普伐他汀对人Ｉ型胶原α１(Ｉ)链启动子活性调控的研究 |
陈倩,吴宗贵,高春芳,王皓
动脉粥样硬化（ＡＳ）病变形成过程包括平滑肌细胞迁移、增殖、细胞外基质增多及脂质沉积等。胶原是动脉壁的主要结构成分。研究表明,随着动脉粥样硬化的进展,Ｉ型胶原的含量增高。因此,如果能够有效抑制Ｉ型胶原的合成,从理论上就可以阻止或延缓动脉粥样硬化进程。临床研究表明,普伐他汀能延缓ＡＳ的发展。既往的研究认为普伐他汀的抗ＡＳ作用与其降低血脂有关。本实验通过对普伐他汀对人Ｉ型胶原α１(Ｉ)链启动子活性调控的研究,从转录水平上了解普伐他汀对Ｉ型胶原合成的影响,从而阐明其抗ＡＳ的另一种可能机制。材料和方法１细胞培养原代培养雄性ＳＤ大鼠胸主动脉平滑肌细胞,采用组织块法。培养基为含１０%ＦＣＳ的ＤＭＥＭ(Ｇｉｂｃｏ),０．２５%胰蛋白酶(Ｓｉｇｍａ)消化传代培养。４～１０代细胞用于实验。２重组体构建［１］载体ｐＣＡＴ３＿Ｅｎｈａｎｃｅｒ(ｐｒｏｍｅｇａ）为一含有ＳＶ４０增强子、氯霉素乙酰基转移酶(ＣＡＴ)报告基因而不含启动子的质粒。所要构建的质粒ｐｈＣＯＬ２．５即是含有人α１(Ｉ）前胶原基因启动子片段-２４８３～+４２ｂｐ序列的重组体。它来自于含人α１（Ｉ）胶原启动序列的质粒ｐ５．３Ｋ人α１(美国ＳｅｒｇｉｏＡ.Ｊｉｍｅｎｅｚ教授惠赠）为模板的ＰＣＲ扩增产物,其５’端引物序列:５＇＿ＡＴＧＴＣ ＴＡＣＧＣＧＴＡＣＡＴＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＣ-３＇；３＇端引物序列为:５＇-ＡＴＡＧＴＡＣＴＣＧＡＧＣＧＴＧＣＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＡＣ-３＇。两端引物分别含６个保护碱基和限制性内切酶ＭｌｕＩ、ＸｈｏＩ识别位点(下划线部分)。为避免一般ＰＣＲ扩增中的随机出错,选用高保真(Ｈｉ-Ｆｉ)ＤＮＡ多聚酶(ＰｗｏＰｏｌｙｍｅｒｓｅ,Ｒｏｃｈｅ)按常规方法进行(ＰＥ-９６００ＰＣＲ扩增仪)。扩增产物经割胶小量柱纯化(华舜生物公司)回收后,用ＭｌｕＩ、ＸｈｏＩ酶切并与相同粘末端的线性ｐＣＡＴ３-Ｅｎｈａｎｃｅｒ载体经Ｔ４ＤＮＡ连接酶(ｐｒｏｍｅｇａ)连接,连接混和物转染至感受态大肠杆菌ＪＭ１０９,并筛选,经小量酶切鉴定正确后,大量扩增阳性克隆,抽提、纯化质拉(Ｑｉａｇｅｎｐｌａｓｍｉｄｍｉｄｉｋｉｔ),紫外分光光度计(Ｄｕ-６００,Ｂｅｃｋｍａｎ）测得率、纯度。３重组体的瞬时转染和普伐他汀的作用重组体的转染采用ＦｕＧＥＮＥ转染试剂(Ｒｏｃｈｅ)：传代培养的平滑肌细胞消化后,按２×１０５细胞密度接种于６孔板(Ｎｕｎｃ)。细胞培养达６０%～８０%融合后,转染ｐｈ ＣＯＬ２．５质粒２ｕｇ。同时转染ｐＳＶβ-ＧＡＬ质粒２ｕｇ作为内对照及含ＣＡＴ的表达质粒(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)１ｕｇ作阳性对照。２４ｈ后,转染的细胞加入普伐他汀１０-３Ｍ,继续培养２４ｈ后,待测报告基因ＣＡＴ活性。４ＣＡＴ,β-ＧＡＬ活性测定及蛋白定量终止培养的细胞用预冷的ＰＢＳ洗三遍后,以裂解缓冲液(Ｒｏｃｈｅ）裂解细胞后,进行蛋白定量(紫外分光光度计Ｄｕ６００,Ｂｅｃｋｍａｎ)、β-ＧＡＬ活性测定及ＣＡＴ-ＥＬＩＳＡ(Ｒｏｃｈｅ)定量。５统计学处理测得ＣＡＴ值数据用ｘ±ｓ表示,采用ｔ检验进行统计分析。
结果
平滑肌细胞经ｐｈＣＯＬ２．５重组体转染,普伐他汀作用２４ｈ后,ＣＡＴ-ＥＬＩＳＡ法测定细胞裂解液中ＣＡＴ表达量,同时测定蛋白浓度。β-ＧＡＬ活性作为内对照使转染效率相同条件下比较ＣＡＴ表达量。ＣＡＴ测定结果用相应蛋白含量及β-ＧＡＬ活性校正后与正常对照组ＣＡＴ的相对比值。对照组ＣＡＴ值设为１,普伐他汀组ＣＡＴ值为０．６２±０．０４,两者经统计分析有显著性差异(Ｐ＜０.０５)。
讨论
曾有学者研究证实ＡＳ病变时各型胶原都有不同程度的增多,特别是Ｉ型和Ⅲ型胶原的增生尤为突出［２］,且随着粥样斑块向晚期进展,Ｉ型胶原增生增多,Ⅲ型胶原增生减少。因此,Ｉ型胶原在ＡＳ病变及进展过程中至关重要。Ｉ型胶原的前胶原由两条α１链和一条α２链构成,胶原蛋白的合成涉及到基因的启动、转录、翻译及翻译后的加工等多个环节,其中转录调控是最基本、最重要的一环。普伐他汀是ＨＭＧＣＯＡ还原酶的竞争性抑制剂,是一种临床上很有效的降脂药,且已证实其有抗ＡＳ作用。过去一直认为其抗ＡＳ作用与降低血脂有关系,ＬＤＬ水平降低后,由氧化ＬＤＬ引发的许多促进粥样斑块形成的过程均减弱［３］。本研究以Ｉ型胶原α１链前胶原基因的启动调控序列为研究对象,构建重组体包含有人α１(Ｉ)前胶原基因５＇侧翼序列-２．５ｋｂ和氯霉素乙酰基转移酶(ＣＡＴ)报告基因,通过瞬时转染平滑肌细胞,从转录水平上研究普伐他汀对Ｉ型胶原基因表达的影响。结果显示,普伐他汀可以明显抑制Ｉ型胶原α１(Ｉ)启动子的活性,从而下调Ｉ型胶原基因的表达。因此我们认为,普伐他汀除了通过降低血脂发挥抗ＡＳ的作用外,抑制Ｉ型胶原α１(Ｉ)启动子的活性及Ｉ型胶原基因表达可能是其抗ＡＳ作用的另一个重要机制。 |
|
|
|
|
|
| |
| |
|
