1、 生化材料
鸡胰腺粉(冻干)
椰子油
腰果酚A
腰果酚B
生物质腰果酚磺酸盐表面活性剂
2、 特种树脂
红外增感树脂
耐溶剂型成膜树脂
热敏相转变树脂
KFP系列树脂
3、 响应型单体
2,4,6-三己氧基重氮苯5-苯甲酰基-4-羟基-2-甲氧基苯磺酸盐
红外增感染料
N-异丙基丙烯酰胺
4-磺酰苯基丙烯酰胺
N,N'-(1,4-亚苯基)双马来酰亚胺(对苯基双马来酰亚胺)
N-对羟苯基丙烯酰胺(AHPAA)
2-氯-1-甲酰-3-羟基亚甲基环己烯
1,1,2-三甲基苯并[e]吲哚
4、手性化合物
5、QINP1系列潜伏性环氧树脂固化剂
6、石材防水背胶(背网专用)
 
 
 
 

磷脂酰肌醇3(PI3K)激酶信号途径对血小板源生长因子促肝星状细胞增殖与I型胶原表达的影响

徐永锋1,管洪庚1 ,薛万江2,岑建农3,谷 敏3
1.苏州大学附属第一医院普外科,江苏苏州215006;
2.南通大学附属医院普外科,江苏南通226000;
3.苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所,江苏苏州215006
  肝纤维化特征表现是以胶原为主的细胞外基质在肝内过度沉积。针对肝纤维化发病机制的研究表明,肝星状细胞(HSC)的激活是肝纤维化发生、发展的中心环节,被看做抗纤维化治疗的主要靶细胞。HSC在病理损伤中由体内多种细胞因子刺激而活化,获得肌成纤维细胞的特性,是细胞外基质的主要来源。其中PDGF是重要的促HSC增殖与活化的细胞因子。肝纤维化是一个可逆性的病变过程,所以阻断乃至逆转肝纤维化已成为慢性肝病防治中的一个关键性问题,具有十分重要的意义。本实验从细胞信号通路的角度,探讨磷脂酰肌醇3激酶信号通路在肝纤维化中的作用,为肝纤维化的防治提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
 大鼠肝星状细胞株HSC T6(由美国Friedman教授惠赠),小牛血清和DMEM培养基(Gibco公司),PDGF BB(PeproTech公司),LY294002(Cayman公司),噻唑蓝(MTT,Amresco公司),总RNA提取试剂盒及RT PCR试剂盒(Promega公司),PCR引物(上海生工合成)。
1.2 方法
1.2.1 PDGF BB对HSC T6细胞增殖的影响
 用MTT法检测细胞的增殖。取对数生长期HSC T6接种于96孔板(1×104/孔),用含20%小牛血清DMEM培养,24h后换无血清的DMEM培养,37℃再孵育24h,排除血清对细胞的促增殖作用,使细胞生长同步化。弃上清,用无血清的DMEM稀释PDGF BB按一系列浓度(0ng/ml,1ng/ml,5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml,50ng/ml)加入各组(每组设6个复孔),继续培养24h。于刺激结束前4h加入MTT20μl(5g/l),37℃孵育4h,弃上清,加150μl二甲基亚砜(DMSO),微震器上振荡10min使结晶融解。酶联检测仪490nm波长检测吸光度(A)值。
1.2.2 LY294002阻断PDGF BB对HSC T6细胞增殖的影响
 用MTT法检测(参照前面的方法)。细胞接种于96孔培养板培养24h,无血清培养基同步化处理24h。用无血清的DMEM稀释LY294002按一系列终浓度(0μmol/l,5μmol/l,10μmol/l,25μmol/l)加入各孔,预处理1h后加入PDGF BB(终浓度10ng/ml)继续培养24h。余步骤同前。每组设6个复孔,经酶联检测仪上于490nm波长检测各孔吸光度(A)值。
1.2.3 RT PCR法检测
   LY294002和PDGF BB处理的HSC T6细胞内Ⅰ型胶原mRNA表达 将对数生长期的HSC接种于6孔细胞培养板中,每孔2ml细胞悬液,细胞生长至80%融合度时,无血清培养基同步化处理24h。实验分组:①PDGF BB10ng/ml(终浓度)处理,②LY294002以25μmol/l预处理1h后再加PDGF BB10ng/ml处理。分别培养0h,24h和48h后收集细胞,用RNA提取试剂盒提取总RNA(按说明书操作),RT PCR试剂盒进行PCR扩增。扩增I型胶原的引物序列为:上游gacttcctggcttcaaaggc,下游gaccctctctttccttcttc,扩增663bp。内参照β actin引物序列:上游tggagaagagctatgagctgcctg,下游gtgccaccagacagcactgtgttg,扩增201bp。扩增反应条件为94℃5min,94℃10s,58℃30s,72℃30s,72℃10min,28个循环。10g/l琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,用Biocap软件对凝胶电泳图像进行扫描定量。
1.2.4 统计学方法
   采用SPSS11.0统计软件对数据进行t检验、方差分析,P<0.05为具有统计学意义。
2 结果
2.1 PDGF BB对HSC T6细胞增殖的影响
   PDGF BB有明显的促进肝星状细胞增殖的作用,在1~10ng/ml时呈明显的剂量依赖关系,当剂量大于10ng/ml时其促增殖作用达到饱和(见表1)。
2.2 LY294002对PDGF BB刺激HSC增殖的影响 LY294002能抑制PDGF BB刺激的HSC增殖,随着LY294002的剂量增加,呈明显的剂量效应关系。当剂量达到25μmol/l时细胞增殖仍高于A组,表明此时仍不能完全抑制细胞增殖(见表2)。


2.3 LY294002和PDGF BB处理的HSC T6细胞内I型胶原mRNA表达变化 PDGF BB处理组,24h、48h的Ⅰ型胶原mRNA相对表达量与阴性对照组(0h组)比分别为112.2%、182.5%,而LY294002加PDGF BB共同处理组则分别为76.4%,52.6%。表明PDGF BB能促进HSC T6表达Ⅰ型胶原,而LY294002则能抑制Ⅰ型胶原表达(见图1)。
3 讨论
    在病理条件下HSC被激活,大量增殖并分泌细胞外基质,是肝纤维化形成的主要参与者。HSC的激活受体内多种细胞因子的调节,如PDGF、TGF β、IGF、HGF、TNF等[1]。PDGF通过与靶细胞上的受体结合而发挥其生物学效应。PDGF有A、B两条肽链,有AA,BB,AB3种结合形式,其中PDGF BB作用最强。PDGF受体也有α、β两型,α型受体与A链或B链结合,β型受体只能与B链结合。本实验采用无血清培养去除了血清中其他细胞因子的影响,结果PDGF BB仍能显著促进HSC增殖。实验亦证实当剂量大于10ng/ml时其增殖刺激作用达到平台期,这与PDGF受体磷酸化饱和有关[2]。PDGF能否促进HSC胶原的表达进而促进细胞外胶原的分泌,各家报道不一。本实验观察到PDGF能直接引起体外培养的HSC细胞内I型胶原的表达,表明其对胶原合成也有促进作用。
    PI3K是细胞生长信号通路中一个重要的激酶,与许多生长因子及其受体有关。PDGF是HSC最强的有丝分裂原,其通过与受体结合可激活PI3K,进而活化PI3K下游的一系列效应因子如Akt、PKC、RS6K等。Akt不仅能被许多生长因子激活,而且也能被其他能激活PI3K的信号分子所激活,导致akt的磷酸化增加。活化的akt能够抑制凋亡,促进细胞的增殖[3]。本实验观察到阻断PI3K通路后,HSC增殖明显受抑制且I型胶原表达减少,提示PI3K信号通路是调节PDGF活化HSC的重要通路。LY294002是PI3K特异性抑制剂,对PI3K发挥抑制效应的IC50为1.4μmol/l[4],实验中使用LY294002浓度达到25μmol/l时仍不能完全阻断PDGF对HSC的促增殖作用,提示PDGF可能还通过其他通路活化HSC[5]。肝星状细胞的活化是肝纤维化的中心事件,逆转肝纤维化的重点是抑制HSC的增殖,减少胶原的合成[6]。肝星状细胞活化到功能改变都是一系列细胞内信号通路的改变的结果,因此阻断某些信号通路的传导可以减少甚至逆转肝纤维化的发生。实验中阻断PI3K信号通路后,HSC的增殖及胶原的合成均受到抑制,因此对该信号通路的进一步研究,将会对肝纤维化治疗提供新的策略。

 
 
 
   
 
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