吴建红　　陕　光*　　张端莲**　　叶庆斌　　郑承庆　　熊　烈
(武汉市传染病医院　武汉430022)
　　肝纤维化是消化系统的一种常见病、多发病,也是肝硬化的前期病理阶段,是由于各种慢性肝损伤引起的肝脏细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)合成增加和(或)降解减少的结果,是慢性肝病重要的病理特征,也是进一步向肝硬化发展的必经之路。其发病机制复杂,治疗效果不十分令人满意,甚至部分肝纤维化可发生癌变,严重影响和威胁人民身体健康。积极探索肝纤维化发病机制,寻求有效治疗措施对降低肝硬化发病率和死亡率具有重要意义。实验研究表明,在肝纤维化阶段进行干预,病变是可以逆转的。川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)是从川芎的生物碱中分离得到的有效单体,具有典型的钙离子拮抗剂的特性,有较强的扩张微血管、改善微循环、降低血黏度、改善血液流变学、调节血小板功能和抗凝等作用,其效果显著。并且有研究报导,川芎嗪具有较强的抗纤维化作用,认为许多细胞的增殖与细胞内的Ca2+和钙调素(CaM)有关,已经发现钙通道和CaM阻滞剂可显著地抑制培养的人胚肺成纤维细胞的增殖。研究证实,川芎嗪可降低博菜霉素所致鼠肺纤维化组织钙含量及钙调素活性,防治鼠肺纤维化。本研究采用免疫组织化学方法检测应用川芎嗪治疗后肝纤维化组织中I型胶原(CollagentypeI,CoI)水平表达的变化,旨在探讨川芎嗪对大鼠实验性肝纤维化作用的治疗效果,并探讨其作用机制,从而开拓一种新的抗肝纤维化药物,为该药的临床应用提供理论依据。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　试验动物　Wister雄性大鼠(SPF级)45只,体重280～360g,由武汉大学医学院动物试验中心提供。食用标准大鼠饲料,饮自来水,室温22℃。
1.1.2　大鼠肝纤维化模型制备及药物应用　将40只大鼠随机分成两组,川芎嗪组20只,对照组20只。另设正常组5只。除正常组以外其它两组均给予40%四氯化碳(CCL4)花生油溶液0.3ml/100g腹腔注射,每周2次,共6周。川芎嗪组于肝纤维化模型建立后给予盐酸川芎嗪(TMP)60mg/kg经口灌胃,1次/d,连续治疗60天;其余两组同时给予同等剂量的生理盐水。于60天后分别处死各组大鼠。取其新鲜肝脏方叶小块组织,10%中性甲醛中固定,常规HE染色观察肝脏组织学改变。
1.2　试剂与仪器
1.2.1　主要试剂
　即用型鼠抗人I型胶原单克隆抗体(北京中山生物技术有限公司);超敏即用型S-P通用型免疫组织化学试剂盒(福州迈新公司);DAB显色试盒及多聚赖氨酸(北京中山生物技术有限公司)。
1.2.2　主要仪器
　YWY781B医用微波仪为浙江临安电子器材厂生产;电热恒温干燥箱为湖北省黄石市医疗器械厂生产;低温冰箱为广州容声冰箱厂生产;显微镜成像系统为日本奥林巴斯公司产品。
1.3　实验方法
1.3.1　常规HE染色
　实验标本经常规固定、脱水、透明、石蜡包埋、切片、HE染色。
1.3.2　免疫组织化学染色S-P法检测I型胶原具体步骤　1组织切片5μm,常规脱蜡至水,蒸馏水洗;23%过氧化氢,37℃孵育10min以抑制内源性过氧化物酶活性,PBS洗4×5min;3I型胶原采用微波抗原修复(3档,10min),PBS洗4×5min;4正常羊血清37℃孵育10min以减少非特异性反应;5一抗(I型胶原,1:40)37℃孵育1h,PBS洗4×5min;6生物素标记的二抗,37℃孵育10min,PBS洗4×5min;7链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物37℃孵育10min,PBS洗4×5min;8DAB显色液显色,自来水冲洗终止反应;9苏木精复染,脱水,透明,封片。用PBS代替一抗作为阴性对照组。
1.4　免疫组织化学结果判断
1.4.1　间质内I型胶原呈棕黄色结构为阳性表达,阴性对照组除细胞核染成蓝色外,胞浆内无棕黄色反应物。
1.4.2　采用HPIAS-2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统(同济千屏影像公司)对I型胶原表达进行定量分析,每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(×400),测定每个视野下阳性反应的平均光密度。以每例5个视野的平均光密度的平均值作为该例的测量值。
1.5　统计学处理
    对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度作单因素方差分析和SNK-q检验,检验水准α为0.05。
2　结果正常对照组肝组织间质内胶原纤维结构呈蓝色或浅黄色,I型胶原呈弱阳性或阴性表达;川芎嗪治疗组肝组织间质内胶原纤维结构也呈蓝色或浅黄色,I型胶原呈弱阳性或阴性表达;肝纤维化模型组肝组织间质内胶原纤维结构呈棕黄色,I型胶原呈强阳性表达。图像分析结果显示:正常对照组CoI表达的平均光密度为0.0571,川芎嗪治疗组CoI表达的平均光密度为0.0526,肝纤维化模型组CoI表达的平均光密度为0.1042。经单因素方差分析,组间有显著性差异(P<0.01)。经q检验,正常对照组与肝纤维化模型组之间、川芎嗪治疗组与肝纤维化模型组之间,CoI的平均光密度有显著性差异(P<0.01),正常对照组与川芎嗪治疗组之间CoI平均光密度的差异无显著性(P>0.05),见表1。

3　讨论
   肝纤维化不是一个独立的疾病,而是许多肝病的共同病理过程。如果肝纤维化同时伴有肝小叶结构的破坏(肝再生结节)者则称为肝硬化。但是,慢性肝病由肝纤维化到肝硬化的过程是连续的,在临床上是难以截然区分的。肝纤维化是各种慢性肝病发展至肝硬化的必由之路,部分甚至发展为肝癌[1],目前仍然缺乏有效的抗纤维化的治疗[2]。寻找有效的抗肝纤维化的药物是目前临床研究的一个热点。盐酸川芎嗪是从中药川芎中提取的一种活性生物碱四甲基吡嗪,具有活血化瘀作用、降低血小板聚集性作用、抑制肿瘤转移作用[3]。川芎嗪是中药川芎的有效成分,对肝细胞具有保护作用,具有一定的阻抑肝纤维化作用。王红等[4]的研究发现,川芎嗪能降低肝纤维化大鼠的血清转氨酶、肝组织中丙二醛及透明质酸含量,提高肝组织超氧化物歧化酶的活性,说明其抗肝纤维化作用与其保护肝细胞、抗脂质过氧化有关。细胞外基质(extracelluarmatrix,ECM)是组成间质和上皮-血管中基质的不溶性结构成分,它不仅是细胞机械支持组织,而且是供给营养和免疫应答的场所,决定细胞的粘附与迁移,在创伤修复和纤维化、细胞的生长、分化、代谢和肿瘤发生和转移中起重要作用。胶原是细胞外基质的主要组成部分,肝纤维化是肝损伤后细胞外基质(ECM),尤其是I型胶原过度增生沉积和降解减少造成的病理性结果,是多种慢性肝病病情发展的共同病理基础。目前认为早期肝纤维化是可逆的,而肝硬化尚不可逆。因此,对早期肝纤维化的防治研究具有特别重要的意义。川芎嗪抗肝纤维化的机制在于抑制HSC激活、肝内胶原的合成及肝内I型前胶原mRNA表达。我们的实验结果显示,肝纤维化模型组大鼠肝内有大量I型胶原沉积,而川芎嗪治疗组肝内胶原沉积较少,显示肝损伤程度较轻,表明川芎嗪对四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化有良好的干预作用,可延缓肝纤维化进程。已经证实,储脂细胞是肝损伤时ECM的主要产生细胞[5～6]。TGF-B主要通过促进ECM的合成与沉积及其抑制ECM的降解来参与肝纤维化的发生。本实验结果尚显示:川芎嗪治疗组肝细胞胞浆内无棕黄色颗粒分布,TGF-β1呈弱阳性或阴性表达,提示川芎嗪能抑制胶原纤维的合成,保护肝细胞,从而减轻和抑制了肝纤维化。