徐萍　张克勤　刘超　刘翠萍　唐伟
　　ＩＧＦ Ｉ是一种含有70个氨基酸残基与胰岛素有相似结构的多肽,它几乎存在于哺乳动物所有组织中,具有促进细胞增殖和分化的功能,成骨细胞含有丰富的ＩＧＦ Ｉ,在骨代谢的调节中起着重要作用。骨质疏松症是以骨量减少、骨的微观结构退化为特征的,致使骨的脆性增加和易于发生骨折的一种全身性骨骼疾病,其发病机制尚不清楚,Ｊｅｈｌｅ等[1]对45名骨质疏松患者与100名健康者研究发现,与同性别同年龄的正常人相比,骨质疏松患者血清游离ＩＧＦ Ｉ下降了73%,总ＩＧＦ Ｉ下降了29%,其中发生过骨折的13名患者上述改变较未发生骨折的患者更为明显。神经性厌食相关性骨量减少和骨质疏松的发生可能与营养不良导致体内ＩＧＦ Ｉ缺乏有关,使用ｒｈＩＧＦ Ｉ能明显增加神经性厌食症妇女的骨密度[2]。这些研究提示ＩＧＦ Ｉ可能与骨质疏松症的发生有关联,但是,ＩＧＦ Ｉ是否直接影响和如何影响骨代谢尚不清楚,本研究通过观察ＩＧＦ Ｉ对体外培养的大鼠成骨细胞增殖、凋亡与Ｉ型胶原蛋白合成的影响,探讨ＩＧＦ Ｉ对骨代谢影响的可能机制。
1　材料和方法
1.1　材料
   新生ＳＤ大鼠(出生后36ｈ内)由江苏省实验动物中心提供,ｒｈＩＧＦ Ｉ购于罗氏公司,为10μｇ无菌冻干粉剂,按产品说明先溶于0.1ｍｌ无菌的0.1ｍｏｌ Ｌ乙酸中,再用无血清ＤＭＥＭ稀释到1000ｎｇ ｍｌ,以0.2ｍｌ体积分装后-20℃保存,使用时以无血清ＤＭＥＭ稀释到设定的浓度;ＤＭＥＭ培养基购于ＧＩＢＣＯ公司,胎牛血清(ＦＢＳ)购于Ｈｙｃｌｏｎｅ公司,ＴＮＦ α购于Ｓｉｇｍａ公司,兔抗大鼠Ｉ型胶原蛋白抗体购于ＢＩＯＤＥＳＩＧＮ公司,生物素标记羊抗兔二抗试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司,ＤＡＢ购于ＡＭＲＥＳＯ公司胰蛋白酶、ＩＩ型胶原酶、ＭＴＴ、ＤＭＳＯ均购于Ｓｉｇｍａ公司,其余试剂均为国产分析纯。
1.2　实验方法
1. 2 .1　成骨细胞培养:采用酶消化法原代培养大鼠成骨细胞,参照文献[3]并略作修改,简述如下:拉颈处死大鼠,于75%乙醇中浸泡3ｍｉｎ后取头盖骨,在Ｈａｎｋｓ液中去除附着的软组织及骨膜后剪碎,0 1%ＩＩ型胶原酶(Ｈａｎｋｓ液)37℃水浴分别消化20和90ｍｉｎ,弃去第1次消化液,收集第2次消化液并离心(1000ｒ ｍｉｎ5ｍｉｎ),细胞团经Ｈａｎｋｓ液洗涤2次后悬浮于含10%ＦＢＳ的ＤＭＥＭ中,台盘蓝染色示活细胞比例为82%～99%,细胞按4×104 ｃｍ2底面积植入培养瓶,在37℃、5%ＣＯ2孵箱中培养24ｈ后换培养基,以后隔天换液,待细胞达80%～90%汇合时(大约5ｄ)以0 25%胰蛋白酶消化,吹打后得到的细胞经完全培养基洗涤2次后传入96孔培养板中待行细胞增殖试验,6孔培养板中待行凋亡检测,24孔板待行免疫细胞化学试验。
1 .2 .2　成骨细胞鉴定:采用钙 钴法碱性磷酸酶(ＡＬＰ)染色进行成骨细胞鉴定,ＰＢＳ洗细胞3次,95%乙醇5ｍｉｎ,蒸馏水洗3次,加入孵育液37℃孵育4～6ｈ,自来水冲洗,2%硝酸钴作用3～5ｍｉｎ,蒸馏水洗3次,1%硫化铵反应2ｍｉｎ,自来水冲洗,光镜下观察,阳性结果呈灰黑色。1. 2 .3　细胞增殖能力测定:第2代成骨细胞以1×105 ｍｌ的密度分别植入3块96孔板中,每板接种36孔,每孔100μｌ,用含10%ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养24ｈ后换无血清ＤＭＥＭ再培养24ｈ(此为清洗期),设立对照组(ｎ=6),仍使用无血清ＤＭＥＭ培养,试验组分别用含不同浓度ＩＧＦ Ｉ(0. 1、1 .0、10、50、100ｎｇ ｍｌ)的无血清ＤＭＥＭ培养,每组6孔,在设定的培养时间(3板分别为24、48、72ｈ)结束前4ｈ每孔加入ＭＴＴ(5ｍｇ ｍｌ)20μｌ,继续培养4ｈ,吸弃孔内培养液,加入ＤＭＳＯ150μｌ,振荡10ｍｉｎ使结晶物充分溶解,490ｎｍ波长测定ＯＤ值。
1. 2.4　细胞凋亡的测定:对数生长期的成骨细胞以4×104 ｍｌ的密度接种于6孔板,每孔3ｍｌ,用含10%ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养24ｈ后换无血清ＤＭＥＭ再培养24ｈ,开始加药刺激,设立对照组(复孔),仍使用无血清ＤＭＥＭ培养;ＴＮＦ α组,分别用含不同浓度ＩＮＦ α(0 .1、1 .0、10、50、100ｎｇ ｍｌ)的无血清ＤＭＥＭ培养(每个浓度做复孔);ＴＮＦ α+ＩＧＦ Ｉ组(复孔),培养基为含有ＴＮＦ α100ｎｇ ｍｌ和ＩＧＦ Ｉ50ｎｇ ｍｌ的无血清ＤＭＥＭ,3组细胞培养72ｈ后,0. 25%的胰酶消化离心,ＰＢＳ清洗,70%预冷酒精悬浮固定细胞,4℃过夜,送南京医科大学流式细胞仪室进行检验,流式细胞仪购于美国ＢＤ公司,型号为ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅＳＥ,碘化啶显色,ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ软件分析。
1. 2 .5　Ｉ型胶原蛋白表达的测定:第2代成骨细胞以4×104 ｍｌ的密度植入事先置有盖玻片(盖玻片经多聚赖氨酸处理)的24孔板中,每孔1ｍｌ,用含10%ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养24ｈ后换无血清ＤＭＥＭ再培养24ｈ,设立对照组(ｎ=6),仍使用无血清ＤＭＥＭ培养,试验组(ｎ=6)的培养液为含50ｎｇ ｍｌＩＧＦ Ｉ的无血清ＤＭＥＭ,培养48ｈ后,爬有细胞的盖玻片经ＰＢＳ清洗,95%的酒精固定,Ｈ2Ｏ2去除内源性过氧化物酶,山羊血清封闭,加一抗4℃过夜,加二抗作用,ＤＡＢ显色,苏木素复染细胞核,中性树胶封片,以ＰＢＳ作为空白对照,兔ＩｇＧ作为阴性对照。光镜下观察,棕黄色为阳性细胞,ＬＥＩＣＡＱ5501Ｗ图像分析系统进行图像分析。
1 .3　统计学处理全部资料采用ｓｔａｔａ7 0统计软件进行分析,所有数据以均数加减标准差表示,采用单因素方差分析进行数据处理,并且根据ＭＴＴ结果的散点图趋势,进行曲线拟合。
2　结果
2. 1　成骨细胞ＡＬＰ染色　　经钙 钴法ＡＬＰ染色,光镜下90%以上细胞染色阳性,呈灰黑色(图1)。

2 .2　成骨细胞增殖能力测定结果
   3个刺激时间均显示ＩＧＦ Ｉ浓度在0～100ｎｇ ｍｌ之间,随着ＩＧＦ Ｉ浓度的递增,细胞的ＯＤ值呈现上升的趋势,其中刺激时间为24ｈ的细胞,ＩＧＦ Ｉ浓度10、50、100ｎｇ ｍｌ三组与对照组有显著性差异(Ｐ<0. 05),再对各浓度试验组之间两两比较,ＩＧＦ Ｉ浓度10ｎｇ ｍｌ分别与50ｎｇ ｍｌ和100ｎｇ ｍｌ组间比较也有显著性差异(Ｐ<0 .05),而50ｎｇ ｍｌ与100ｎｇ ｍｌ两组之间差异无显著性;刺激时间为48ｈ的细胞,所有5个浓度的试验组与对照组比较都有显著性差异(Ｐ<0 .05),进一步分析显示,除0. 1与1ｎｇ ｍｌ之间的差异没有显著性其余均有显著性(Ｐ<0 .05);刺激时间为72ｈ的细胞,所有5个浓度的试验组与对照组比较都有显著性差异(Ｐ<0. 05),再对各浓度试验组之间两两比较,除0. 1与1、1与10ｎｇ ｍｌ之间的差异没有显著性,其余均有显著性(Ｐ<0 05)。根据本资料的散点图趋势,认为可拟合指数曲线模型,三个指数曲线方程分别为24ｈ:^ｙ=0 .2173976+0 .0103678′ｌｏｇ10(ｘ+0 .01),(Ｐ<0 .05,Ｒ2=0 9871);48ｈ:^ｙ=0 2416892+0 0331555′ｌｏｇ10(ｘ+0. 01)(Ｐ<0 .05,Ｒ2=0 8306);72ｈ:^ｙ=0. 2810705+0 .0312716′ｌｏｇ10(ｘ+0 .01)(Ｐ<0 .05,Ｒ2=0 .8424),根据拟合优度和回归图判断,三条指数曲线拟合的效果是满意的,见表1,图2。
2 .3　成骨细胞凋亡及细胞周期的测定结果
   流式细胞仪检测显示成骨细胞凋亡率随ＴＮＦ α浓度的增高而增加,与对照组相比有显著性差异(Ｐ<0 05),提示ＴＮＦ α有明显的诱导成骨细胞凋亡的作用。各浓度组随着ＴＮＦ α浓度的递增Ｓ期的细胞比例逐渐减少,当ＴＮＦ α浓度为10、50和100ｎｇ ｍｌ时与对照组相比有显著性差异(Ｐ<0 05),各浓度组Ｇ0 Ｇ1期细胞比例与对照组相比虽然没有显著性差异(Ｐ>0 05),但均高于对照组,而Ｇ2 Ｍ期变化不明显,提示ＴＮＦ α可阻滞成骨细胞由Ｇ0 Ｇ1期进入Ｓ期,抑制细胞增殖。在加入ＩＧＦ Ｉ后细胞的凋亡率明显减低(Ｐ<0 05),Ｓ期细胞比例明显增加(Ｐ<0 05),提示ＩＧＦ Ｉ有明显的抑制细胞凋亡、促进细胞增殖的作用(表2)。
2 .4　成骨细胞Ｉ型胶原蛋白表达的测定结果
   大鼠成骨细胞经50ｎｇ ｍｌＩＧＦ Ｉ刺激48ｈ后,Ｉ型胶原蛋白的表达明显增加(图3)。对照组与试验组各随机取片3张,每张玻片随机取10个视野,经ＬＥＩＣＡＱ5501Ｗ病理分析软件分析显示,0ｎｇ ｍｌ组为97. 39±5. 311,50ｎｇ ｍｌ组为85 .49±3 .261,试验组Ｉ型胶原蛋白平均灰度较对照组降低12. 2%(Ｐ<0 .001)。

3　讨论
   成骨细胞是骨的形成、骨骼发育与生长的重要细胞,它能向其周围产生胶原纤维和基质,并且有促进基质钙化的功能。本研究的结果显示ＩＧＦ Ｉ能明显增加培养的大鼠成骨细胞数量,在ＩＧＦ Ｉ的浓度为0 .1～100ｎｇ ｍｌ之间,作用时间为24、48和72ｈ呈浓度依赖性,并且作用时间在48ｈ和72ｈ,浓度在1～100ｎｇ ｍｌ之间这种作用更为显著。ＩＧＦ Ｉ增加培养的大鼠成骨细胞数量既可能是由于促进增殖作用,也可能由于抑制凋亡作用,或两者兼有所致;为了进一步探讨ＩＧＦ Ｉ对成骨细胞增殖的影响,我们采用流式细胞仪技术对成骨细胞的凋亡进行测定,首先使用无血清的培养基培养成骨细胞观察在饥饿状态下成骨细胞的凋亡情况,结果显示经饥饿72ｈ后成骨细胞的凋亡率仅为0 .72%,Ｊｉｌｋａ等[4]报导成骨细胞在体内的凋亡率仅为0%～0 .6%,说明在没有凋亡诱导剂的作用下成骨细胞在体内和体外均不容易发生凋亡,在ＴＮＦ α作用后凋亡率才有所上升,因此ＭＴＴ显示试验组成骨细胞数量的增加可能与ＩＧＦ Ｉ对成骨细胞的促增殖作用有关,Ｄ ａｖｉｓ等[5]研究发现ｒｈＩＧＦ Ｉ能增加各年龄人成骨细胞样细胞脱氧胸腺嘧啶核苷的合成,促进细胞的增殖。当然,ＩＧＦ Ｉ对成骨细胞促增殖作用的具体机制尚有待进一步研究。细胞凋亡是一个主动的、程序化的细胞固有的死亡过程,细胞凋亡受细胞内特定基因及多种因子的调控,ＴＮＦ α是一种具有杀伤肿瘤细胞功能的细胞因子,大量研究表明ＴＮＦ α与细胞凋亡之间的关系异常密切,认为ＴＮＦ α的抗肿瘤机制中,诱导肿瘤细胞凋亡是其中一种重要的途径。实验证明ＴＮＦ α也能诱导成骨细胞凋亡[6,7],本研究使用不同浓度的ＴＮＦ α刺激成骨细胞,结果显示ＴＮＦ α对成骨细胞的促凋亡作用呈浓度依赖性,并且ＴＮＦ α使成骨细胞阻滞在Ｇ0 Ｇ1期,抑制成骨细胞的增殖,而用ＩＧＦ Ｉ与ＴＮＦ α共同刺激成骨细胞发现凋亡率明显减低了,提示ＩＧＦ Ｉ对ＴＮＦ α诱导的成骨细胞凋亡有明显的抑制作用。以往研究发现ＴＮＦ α在体外有抑制骨形成和促进骨吸收的作用,ＴＮＦ α能抑制成骨细胞碱性磷酸酶(ＡＬＰ)的活性和Ｉ型胶原蛋白的合成,并且ＴＮＦ α可诱发骨母细胞产生一种破骨细胞活化因子,促进破骨细胞的骨吸收。本实验显示ＴＮＦ α对骨形成的抑制作用可能与其促使成骨细胞凋亡有关联,ＩＧＦ Ｉ抑制了ＴＮＦ α诱导的成骨细胞凋亡间接的显示了其促进骨形成的作用。ＩＧＦ Ｉ是维持体内许多组织正常生长的重要生长因子之一,ＩＧＦ Ｉ还能抑制许多肿瘤细胞株的凋亡,ＶａｎＧｏｌｅｎ等[9]研究发现ＩＧＦ Ｉ可能通过调节抗凋亡蛋白Ｂｃｌ 2和Ｂｃｌ ＸＬ在体内的水平来抑制神经母细胞瘤细胞的凋亡,Ｈｉｌｌ等[6]实验发现ＩＧＦ Ｉ能促进体外培养的小鼠成骨细胞的增殖,并能抑制其凋亡。Ｆａｒｌｅｙ等[7]研究发现ＩＧＦ Ｉ在体外实验中呈剂量和时间依赖性抑制ＴＮＦ α诱导的人骨肉瘤细胞和成骨细胞凋亡同时伴有ＡＬＰ活性的改变,认为ＩＧＦ Ｉ抑制凋亡的作用可能与成骨细胞合成ＡＬＰ的能力有关,或者ＡＬＰ活性的改变是成骨细胞凋亡而导致的结果,目前尚未清楚。
   我们又通过细胞免疫化学的方法观察ＩＧＦ Ｉ对大鼠成骨细胞Ｉ型胶原蛋白合成的影响,结果发现经过ＩＧＦ Ｉ的刺激后成骨细胞Ｉ型胶原蛋白的合成明显增加(Ｐ<0 001)。Ｉ型胶原蛋白是成骨细胞分泌的一种基质蛋白,是骨胶原的重要组成部分,经矿化后为骨骼提供支架。很早就有学者通过3Ｈ 脯氨酸掺入法测定体外培养的大鼠成骨细胞胶原合成的能力[10],证明ＩＧＦ Ｉ使培养基中Ｉ型胶原蛋白的降解减少,ＩＧＦ Ｉ对大鼠成骨细胞这种作用与其促增殖作用无关,因为在使用ＤＮＡ合成抑制剂羟基脲时这种作用仍然存在;Ｔｈｏｍａｓ等[11]使用ＩＧＦ Ｉ刺激体外培养的人骨髓基质细胞(ｈＭＳＣ,能诱导分化为成骨细胞)发现ＩＧＦ Ｉ能促进分化的ｈＭＳＣ和成熟的成骨细胞Ｉ型胶原的基因表达,在基因水平证实了ＩＧＦ Ｉ促进骨基质的合成,本研究通过细胞免疫化学的方法在蛋白质水平证实了ＩＧＦ Ｉ明显增加Ｉ型胶原蛋白的合成,促进了骨形成。但是ＩＧＦ Ｉ对Ｉ型胶原蛋白合成的促进作用除了上调其基因表达,可能还存在其他机制,有待进一步研究。综上所述,本研究通过体外细胞培养实验显示ｒｈＩＧＦ Ｉ促进成骨细胞的增殖、抑制ＴＮＦ α诱导的成骨细胞凋亡,促进成骨细胞Ｉ型胶原蛋白的合成,提示ＩＧＦ Ｉ有可能促进骨的形成。