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建立ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ实时ＲＴＰＣＲ定量检测大鼠Ｉ型胶原ｍＲＮＡ水平方法 |
温冬青１，赵锦荣１，孔亚林２，郭慧芳１，阎小君１
（第四军医大学：１全军基因诊断技术应用研究所，２西京医院肝胆外科，陕西西安７１００３３）
０ 引言
近年来，肿瘤间质的来源及间质成分的变化［１］与肿瘤浸润转移的关系［２］逐渐受到人们的重视；骨、牙齿及皮肤等发育［３］的各个时期中各种主要组成成分的表达量的变化也成为发育和疾病监控在基础研究方面的趋势．而这些领域的研究热点常集中在基质金属蛋白酶及其抑制剂的研究上，而对作为细胞外基质主要成分之一的Ｉ型胶原的表达变化却少有报道．实时荧光ＰＣＲ技术是目前最准确、重现性最好和国际公认的核酸分子定量定性检测标准方法，被广泛用于转基因研究、基因表达研究、药物疗效考核、病原体检测等诸多领域［４－７］．已出现的荧光定量ＰＣＲ方法有多种，其中应用前景最广的方法是ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ荧光染料法［８］和ＴａｑＭａｎ探针法［９］．本文基于ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ荧光染料利用实时荧光ＰＣＲ技术就建立检测大鼠Ｉ型胶原表达水平的方法进行探讨．
１ 材料和方法
１．１ 材料
ＳＤ大鼠（６ｗｋ）取自西京医院肝胆外科，体质量２２５ｇ．总ＲＮＡ提取、逆转录相关试剂使用ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ产品；ｐＭＤ１８Ｔ载体（ＴａＫａＲａ公司）；ＰＣＲ产物清洁试剂（Ｖｉｔａｇｅｎｅ技术有限公司）；ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ荧光染料（罗氏公司）；ＤＨ５а感受态菌株（本所保存）；普通ＰＣＲ仪（ＴＥＣＨＮＥ）；实时荧光定量ＰＣＲ仪ＤＮＡＥｎｇｉｎｅＯＰＴＩＣＯＮＴＭ（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ）；ＤＵ６４０核酸及蛋白分析仪（Ｂｅｃｋｍａｎ公司）；凝胶成像系统（Ｋｏｄａｋ公司）．１．２ 方法１．２．１ 抽提总ＲＮＡ 正常大鼠处死，取８０ｍｇ肝脏组织，按Ｔｒｉｚｏｌ操作说明书提取总ＲＮＡ．２０ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶电泳鉴定所提ＲＮＡ的完整性．测定吸光度，确定ＲＮＡ的含量和纯度．
１．２．２ 目的
ｃＤＮＡ的ＰＣＲ扩增 按反转录试剂说明书进行ｃＤＮＡ的合成．根据大鼠Ｉ型胶原ｍＲＮＡ序列［１０］，运用ＤＮＡＳＴＡＲ软件设计一对特异性引物，分别为：５′ＣＴＣＡＧＧＧＧＣＧＡＡＧＧＣＡＡＣＡＧＴ３′和５′ＡＴＧＧＧＣＡＧＧＣＧＧＧＡＧＧＴＣＴ３′．扩增片段长度为１２５ｂｐ．反应参数为９５℃变性３０ｓ，５８℃退火４０ｓ，７２℃延伸２０ｓ，共３５个循环．
１．２．３ 参比模板质粒构建 ＰＣＲ扩增产物纯化后，克隆至ｐＭＤ１８Ｔ载体，由上海生物工程公司进行序列测定．
１．２．４ 实时荧光ＰＣＲ反应系统敏感性测试及线性标准曲线绘制 提取参比模板质粒，定量后分级１０倍稀释至５×１０５／Ｌ，分别取每一数量级稀释液２μＬ作为ＰＣＲ模板，即每５０μＬ反应体系中含有模板拷贝数分别为１００，１０１，１０２，１０３，１０４，１０５，１０６，１０７，１０８．除反应体系中引入２×ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ荧光染料［１１］及循环数改为５０外，其他同上，同时设立以水和空载质粒为模板（即靶基因拷贝为０）的对照反应．
１．２．５ 实时荧光ＰＣＲ反应系统特异性评定 基于ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ荧光染料的实时ＰＣＲ反应的特异性评定是通过分析ＰＣＲ产物的熔链曲线来实现的，不同的ＰＣＲ产物其熔链曲线也不同．将实时定量ＲＴＰＣＲ产物从５０℃缓慢而均匀地升温至１００℃，温度每升高０．２℃读一次荧光值，每两次读值间隔１ｓ，由实时荧光定量ＰＣＲ仪自动绘制熔链曲线．
２ 结果
所提ＲＮＡ吸光度Ａ２６０ｎｍ／Ａ２８０ｎｍ＝１．８，浓度为０．６９６８４ｇ／Ｌ．２０ｇ／Ｌ琼脂糖变性电泳见５ｓ，１８ｓ，２８ｓ三条清晰条带．ＰＣＲ扩增产物经２０ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶电泳可见大小约为１２５ｂｐ（图１）．经在线序列相似性分析（Ｂｌａｓｔｎ），所克隆序列同靶基因序列有１００％的同源性． 在１００至１０８ＤＮＡ拷贝／每反应范围内（图２），Ｃｔ值和ＤＮＡ拷贝数呈线性关系（ｙ＝－０．３１ｘ＋１２．５２；ｒ＞０．９９０）．所建立的实时荧光ＰＣＲ反应系统的检测最低限度可达１拷贝／反应（图３）．除最高浓度参比品及对照品外（图４），其他浓度参比品扩增产物的熔解曲线一致．
3讨论
基于sYBRG。。nl荧光染料所建立的实时PcR法具有无毒、无放射性污染、操作简便、不需设计特异性荧光探针及其配套引物、敏感性高、反应条件优化和设计思路简单、成本较低等特点，只要反应条件合适即可实现任何目的基因的实时定量．但由于ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ荧光染料为双链ＤＮＡ特异性染色，它不仅和靶基因的扩增产物结合，也会同非特异性ＰＣＲ产物结合，从而影响结果判断．故引物设计及ＰＣＲ条件优化显得尤为重要，要求务必确保ＰＣＲ扩增产物的条带清晰且单一．进行熔链反应时，随着温度逐渐升高双链解链，荧光信号随之下降．当温度在Ｔｍ值左右时双链数量急剧减少，荧光量也急剧下降，由此可确定Ｔｍ值．结果显示特异扩增产物熔解温度均一、峰的形状也比较锐利，空白对照熔解曲线同靶基因产物的明显不同．实时ＰＣＲ反应结束时应减去空白信号以去除二聚体等实物的影响，也可直接通过控制循环次数以使反应在出现明显的二聚体信号前结束．在实验中也发现含有１０８拷贝参比模板的反应Ｔｍ值同其他梯度参比模板有偏差，可能主要是高拷贝数载体的双链ＤＮＡ所引起的．由于在定量分析时，每反应通常只需各取１０３，１０４，１０５和１０６个拷贝的模板为参比品，故此值并不影响今后的检测分析． |
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