西安交通大学第二附属医院(西安710004)　
闫小宁　冯　捷　张彩晴　李文彬　崔　荣
　　我们运用免疫组化方法对结缔组织生长因子和纤维粘连蛋白在硬皮病小鼠模型蛋白含量表达的检测,研究在硬皮病发病中的作用,探讨硬皮病发病的内在机理。
材料和方法
1　实验动物
　雌性SPF级BALB/c小鼠24只,6周龄,体重(20±5)g购自西安交通大学医学院动物试验中心。清洁级动物饲养室室温20℃～24℃普通饲料和水饲养喂养。
2　主要药品
　博来霉素粉针(BLM),15mg/支,日本化药株式会社产品,批号:450260,0.01mol/L,pH7.4磷酸缓冲液(PBS)西安交通大学医学院中心实验室配置。
3　主要试剂和仪器
　多克隆抗体兔抗鼠COL-I型胶原抗体(1∶50),多克隆抗体兔抗鼠CTGF抗体(1∶50)为武汉博士德生物工程公司产品;ElivisionTMplus试剂购自福州迈新生物技术开发有限公司,即用型。
4　硬皮病动物模型制作
　把BALB/c小鼠随机分成2组,模型组12只,对照组12只,均剃除背部中央区被毛,模型组以41/2注射针头,皮下注射200μg/m1BLM溶液0.lml,1次/d以连续3周后,造模结束;对照组每只在同一部位注射0.01mol/LPBS3周。最后1次给药后的24h用颈椎脱臼法处死小鼠,切下背部注射部位皮肤,置10%甲醛溶液固定石蜡包埋。
5　皮肤和肺组织病理学观测
　常规制作皮肤和肺组织切片行HE染色,以观察皮肤和肺组织学改变,观察胶原纤维增生情况及血管的变化。
6　免疫组化检测
　皮肤、肺组织蜡块连续切片脱蜡水化后,PBS洗3min3次置于盛有柠檬酸盐缓冲液的热修复盒,在医用微波炉内92℃～97℃保持10min进行抗原修复,PBS洗3min3次;滴加50μl3%过氧化氢溶液,室温孵育10min,PBS洗3min3次滴加抗体CTGF或COL-I50μl,4℃过夜,PBS洗5min3次;加1滴聚合物增强剂,室温孵育20min,PBS洗3min3次:加酶标抗鼠/兔聚化物50μl,室温孵育30min,PBS洗3min3次;滴加DAB显色液1滴,自来水冲洗,苏木素复染,0.1%盐酸分化自来水冲洗,PBS返蓝;梯度乙醇脱水干燥,中性树胶封片。镜下观察结果阴性对照以PBS代替第1抗体。
7　结果判定标准
7.1　皮肤组织染色:阳性反应颜色为棕黄色或棕褐色,采用全自动彩色病理图像分析系统(MIAS2000型软件),在100倍光镜下测量每个显示屏的阳性染色面积和染色强度(积分光密度)。每张切片随机取5个大小相等的视野进行半定量分析,计算每一视野中COL-I及CTGF,免疫组化阳性表达强度,测定其表达的阳性面积,然后计算平均值。计算出每只小鼠的免疫组化指数。免疫组化指数=(阳性面积值×阳性强度)。
7.2　肺组织形态定量分析:根据文献[1]将肺组织分为以下分3个区域:1无染色区:代表肺泡腔面积;2深染色区:代表细胞核所占面积;3浅染色区:代表纤维结缔组织与胶原纤维所占面积。将HE染色的切片置于图像分析仪的显微镜上,在HE×100下每份切片选取6个视野进行图像处理,每组分析36例次,自动测出各部分所占面积,取其平均值(μm2)。
8　统计学分析
　全部数据用均数±标准差表示,用SPSS12.0软件进行统计学处理,用t检验对各组间数据进行分析。
结　果
1　造模组小鼠一般情况:造模组小鼠经BLM处置后,体重减轻,喜静,活动减少,全身毛发色泽变淡,其背部注射部位皮肤明显增厚变硬,弹性差,皮毛未见生长。常规组织切片行HE染色,可见真皮层明显增厚胶原纤维明显增粗、膨大,数量增多,纤维间隙变窄,排列紧密,毛囊萎缩,血管增粗,血管壁增厚,内腔狭窄,伴有炎性细胞浸润。肺组织出现肺泡间隔增厚伴大量单核细胞浸润,间隙有少量成纤维细胞增生,小血管壁增厚。
2　COL-I免疫组化指数比较:造模组和对照组皮肤COL-I免疫组化指数的比较,见表1。由表1可以看出造模组小鼠皮肤COL-I免疫组化指数比对照组该指数均有明显增加(P<0.05)造模组小鼠皮肤CTGF免疫组化指数比对照组该指数亦有明显增加(P<0.05)。

3　形态定量分析:结果见表2。由表2可见,与对照组相比,模型组深染区面积明显最大(P<0.01),表明炎性细胞增多,肺泡炎症明显;浅染区面积有增加,差异有显著性(P<0.05),无染区面积有减少的表现,差异有显著性(P<0.05),提示肺间质纤维化增加,肺泡腔缩小。
4　CTGF、COL-I相关性分析:采用SPSS统计软件分析,I型胶原表达与CTGF表达的相关性显示造模组小鼠皮肤I型胶原的表达与CTGF表达呈显著正相关性(P<0.05)。
讨　论
    硬皮病以局限性或弥漫性皮肤或伴有内脏器官进行性纤维硬化为特征。CTGF是一种新发现的促成纤维细胞分裂和胶原沉积的细胞因子,属于一种即刻早期基因,广泛存在于人类多种组织器官,如心脏、肺脏、皮肤和结缔组织中。它具有加速DNA合成、促进细胞增殖;调节细胞外基质基因的表达和ECM合成;介导细胞粘附刺激细胞迁移;促进新生血管形成;促进软骨发生和骨骼发育等生理作用。病理情况下,CTGF过度表达与某些增生性和纤维化疾病的发生密切相关,如肺纤维化和硬皮病等。IgarashiA等[2]通过原位杂交检测系统性硬皮病患者病变组织中CTGF基因的表达,发现在病变皮损处有强阳性CTGFmRNA的表达,然而同一患者的正常皮肤标本中则无表达。Querfeld等在对硬皮病的研究中发现,TGF-β表达增高仅发生在炎症皮损早期[3],而CTGF的高表达则持续至硬化晚期,且表达程度与硬化程度正相关[2]。
    Sato[4]等发现系统性硬皮病患者血清中CTGF的水平明显增高。且其增高程度与皮肤纤维化和肺纤维化的程度呈正相关。Frazier等观察了CTGFmRNA在博莱霉素诱导的大鼠、小鼠肺纤维化模型中各个阶段的表达特点,首次证明了大鼠肺成纤维细胞同样能够表达CTGF,其表达规律与TGF-β有着密切的联系,并与肺纤维化的程度密切相关[5]。
    本研究模拟日本学者Yamamoto硬皮病的造模方法。在BALB/c小鼠背部皮下注射博来霉素3周后,表现出了较典型的硬皮病组织病理改变,表明用博来霉素诱导BALB/c小鼠建立硬皮病模型具有操作简便,重复性好经济实惠的特点。本研究首次用免疫组化探讨了CTGF和COL-I在博来霉素诱导的硬皮病小鼠皮肤和肺中的蛋白含量表达,发现其表达值较正常对照组显著增高,这与廖朝晖等用原位杂交法检测结缔组织生长因子mRNA在硬皮病模型小鼠真皮中的高表达相符合[6]。CTGF和COL-I表达较对照组明显上调,且二者有一定的相关性,说明CTGF及COL-I在硬皮病小鼠模型皮肤硬化过程中起重要作用,CTGF的表达与硬皮病皮肤和肺的纤维化形成、发展密切相关,是纤维化形成过程中的重要介质。结缔组织生长因子通过蛋白激酶C途径诱导 型胶原mRNA的转录,使胶原纤维的合成增多同时激活成纤维细胞,使其增殖、分化,分泌细胞外基质及表达黏附分子等参与硬皮病的发展[7]。TGF-β是导致组织纤维化形成的最重要的细胞因子之一但其作用广泛、效应复杂限制了抗TGF-β抗体的应用。而作为TGF-β下游介质的CTGF,阻断或者抑制其表达可能是种比较特异和有效的治疗纤维化疾病的方法。因此在治疗上阻断CTGF表达或抑制其活性对硬皮病所致的皮肤、肺脏纤维化的形成提供了新的思路。