张云松， 高建华， 鲁 峰， 朱 茗， 廖云君
（南方医科大学南方医院整形外科， 广东 广州 ５１０５１５）
 人脂肪干细胞具有增殖能力和多向分化潜能，对多种组织的损伤具有良好的修复作用， 而且取材方便， 是组织工程研究中的重要种子细胞之一［１，２］。理想的种植材料应具有良好的生物相容性， 对细胞、组织等无毒性。不同材料对细胞的生长、分化和黏附均有不同的影响， 因而种子细胞能否在支架材料上良好生长， 并表达自身特异性功能是目前组织工程研究的一个热点。本实验首次用人脂肪干细胞与 Ｉ 型胶原支架材料进行体外混合培养， 了解支架材料对细胞粘附、生长、增殖等功能的影响， 以便寻找适宜的脂肪组织工程细胞载体， 为进一步的体内实验提供理论依据。
１ 材料与方法
１．１ 试剂
 ＤＭＥＭ、特级胎牛血清由 Ｇｉｂｃｏ 公司生产； Ｉ 型胶原酶、胰蛋白酶、Ｉ 型胶原支架材料、四氮唑复合物（ＸＴＴ）， 硫酸酚嗪甲酯和二甲基亚砜均购自 Ｓｉｇｍａ， １
孔细胞培养板购自 Ｃｏｒｎｉｎｇ。
１．２ 方法
１．２．１ 脂肪组织来源的脂肪干细胞（ＡＤＳＣＳ） 原代、传代培养［２］ 取人吸脂术中吸出的脂质部分， 用缓冲液反复冲洗， 剪刀剪碎。０．１％胶原酶 ３７ ℃消化 ４０ ｍｉｎ，期间需反复震荡混匀 １ 次， 使用等量体积的完全培养基中和后， 离心 １３００×ｇ ５ ｍｉｎ， 去上清， 沉淀混悬后使用肽盼蓝染色检测细胞活性， 加入 １０％ ＤＭＥＭ 培养基中， ３７ ℃５％ ＣＯ２ 孵箱培养过夜。待细胞生长融合达 ８０％即可传代， 取第 ３￣４ 代细胞供实验用。
１．２．２ 细胞 － 支架复合物的形成 将胶原蛋白支架材料裁制成 １０ ｍｍ ×１０ ｍｍ ×１ ｍｍ 大小， 利用紫外线照射及酒精浸泡消毒， 培养液平衡后待用。培养的脂肪干细胞消化后制成细胞悬液， 细胞密度为 ２×１０５／ｍｌ，表面种植 ０．２ ｍｌ 细胞悬液， 静置 ４ ｈ 后，加入含 ２０％胎牛血清的 ＤＭＥＭ 培养液， ３７ ℃、     ５％ ＣＯ２ 培养箱中培养。
１．２．３ 倒置显微镜观察 细胞接种支架后， 动态观察细胞在支架上粘附、伸展、生长、分裂情况。
１．２．４ 细胞黏附率检测 根据 Ｋａｓｔｅｎ 报道的方法 做 ［３］了部分改进。取 ２４ 孔培养板，在孔内植入备用的胶原蛋白支架材料 ７ 块， 大小约 １０ ｍｍ ×１０ ｍｍ ×１ ｍｍ将细胞浓度为 ２×１０５／ｍｌ 的细胞悬液 ０．２ ｍｌ 滴加到料上，静置 ４ ｈ 后，置于孵育箱中复合培养 ４ ｈ， 换于另一平皿， 加入培养液， 将原平皿中细胞消化收集， 计数仪计数， 得出流失的细胞数； 细胞材料复合物培养 ２４ｈ 后， 在培养液中轻轻晃动， 换于另一平皿， 重复上述步骤， 得出未黏附细胞数。粘附率 ＝（接种细胞数 － 流失细胞数 － 未粘附细胞数）／ （接种细胞数 － 流失细胞数）×１００％。
１．２．５ ＸＴＴ 比色法［４］测定细胞增殖状况 将胶原支架材料 ７ 块（５ ｍｍ×５ ｍｍ×１ ｍｍ）分别置于 ９６ 孔培养板中， 并设 ７ 孔为不加材料的空白对照组， 各 ４ 个复孔。
将 ＡＤＳＣＳ 以 １×１０４／ 孔接种于材料及空白孔， 置 ３７ ℃５％ ＣＯ２ 孵箱培养 ３、５、７ ｄ， 以主波长 ４５０ ｎｍ， 参比波长 ６３０ ｎｍ 在酶标仪上比色， 测定吸光度 Ａ 值。
１．２．６ 扫描电镜观察 细胞 － 支架复合物体外培养至３ ｄ 和 ７ ｄ 时， 取出材料， ３％戊二醛固定， 梯度酒精脱水， 临界点干燥， 横截面表面喷金， 扫描电镜观察。
１．２．７ 统计学处理 所得数据采用 ＳＰＳＳ１１．０ 软件包进行统计分析， Ｐ＜０．０５ 为差异有显著意义。
２ 结果
２．１ 细胞 － 支架复合物倒置显微镜观察
  刚接种的细胞呈圆形， 在支架材料内均匀分布；透光性差， ２４ ｈ 内细胞伸展、黏附，透光性增加， 不易观测。 ２￣３ ｄ 已完全伸展变形， 以三角形和梭形为主， 呈网状排列；随着培养时间的延长，支架上的细胞逐渐由梭形变成圆形， 种植 ７ ｄ 后， 细胞数量明显增加，极少细胞从支架上掉落。表明脂肪干细胞能在支架上良好地附着、生长和增殖（图 １）。
２．２ 细胞黏附率检测
  经检测， ７ 块复合材料中， 每块细胞黏附率均达９５％以上， 平均达 ９７．９％， 说明该支架对细胞有良好的黏附性。
２．３ ＸＴＴ 法检测材料上细胞增殖情况
  从活细胞吸光度所绘制的细胞增殖柱形图来看（ 图 ２）， 细胞接种后， 实验组和空白组随时间延长细胞活性逐渐增加， 仍可保持正常的分裂增殖速度， 两
组之间组相比未见显著性差异（Ｐ＞０ ．０５）。

２．４ 扫描电镜观察
 细胞种植 ３ ｄ 后， 细胞呈扁平多角形或圆形， 在材料表面伸展、黏附； 种植 １ 周后， 形态为梭形或圆形， 细胞数量明显增多， 呈聚集性分布， 细胞周围有大量基质， 表明脂肪干细胞在支架上粘附、伸展和生长良好（图 ３）。

３ 讨论
  胶原蛋白是目前组织工程学研究中最常用的天然生物材料， 由多种糖蛋白分子组成， 占机体总蛋白的 ３０％ （８５％为 Ｉ 型胶原蛋白）， 它具有多方面的生物活性， 不仅是组织支持物， 而且是细胞外间质的重要成分。研究表明， 胶原蛋白生物相容性好， 降解速度可调， 而且可参与组织修复， 是一类优良的可引导组织再生的生物材料。Ⅰ型胶原作为体外细胞培养支架时， 有促进细胞粘附和诱导生长分化的作用， 是良好的培养粘附剂。其降解产物可被细胞利用合成新的基质。不产生毒性代谢产物， 不影响内环境 ｐＨ 值， 因此不会影响细胞的生长增殖。胶原蛋白及相关制品已广泛应用于临床医学中［５，６］， 已被美国 ＦＤＡ 批准作为人工皮肤材料［７］。
    本研究利用人脂肪干细胞作为种子细胞， 进行体外细胞种植胶原支架， 通过倒置显微镜和电镜观察细胞伸展、黏附和生长过程。镜下显示， 种子细胞种植胶原材料后， 生长状态良好， 无明显细胞毒性表现， 在培养条件相对稳定的情况下， 细胞可以进行正常增殖、迁移并分泌细胞外基质。通过检测， 细胞与支架的黏附率达 ９７％以上， 说明该支架对细胞有良好的亲和性。
    ＸＴＴ 法常用于体外细胞增殖和药敏检测， 通过测定活细胞光吸收值， 间接反映活细胞数量。本实验中， 细胞支架培养复合培养后， 材料接种组细胞的增殖未受到不良影响， 说明 Ｉ 型胶原支架对人脂肪干细胞无毒性作用。
     本实验表明， 人脂肪干细胞能在 Ｉ 型胶原支架材料上良好的附着、生长、增殖并在三维支架材料内保持均匀分布。Ｉ 型胶原支架材料与人脂肪干细胞具有良好的体外生物相容性， 可作为构建脂肪组织工程的细胞载体。