魏恩会　陈　琪**　陈秀英　王　南　史新峰1
(南京医科大学动脉粥样硬化研究中心,南京210029)
　　氧化性修饰低密度脂蛋白(ox-LDL)在动脉粥样硬化(As)发病机制中的作用,近年来受到广泛重视。目前认为,LDL的氧化主要发生于血管内膜下层,大部分动脉壁细胞成分均可诱导LDL发生脂质过氧化反应。最近Camejo等人[1]指出,LDL与细胞外基质成分蛋白多糖结合后,其氧化反应敏感性增加,因而可加速动脉粥样硬化的发生发展。然而作为细胞外基质中最重要的有形成分——胶原,在LDL氧化过程中是否起作用至今未见报道。已知动脉壁中大部分的LDL结合于细胞外基质[2],经氧化修饰后其与基质的结合能力明显增强[3]。为进一步探讨LDL在胶原存在条件下对氧化反应敏感性的改变,我们制备了I型胶原凝胶,首次观察了其对Cu2+和2,2′-盐酸脒基丙烷(AAPH)介导的LDL氧化反应敏感性的影响。
材料和方法
1.1　I型胶原凝胶的制备
    按Elsdale等方法进行,即取新鲜处死的大鼠鼠尾数条,用70%的酒精浸泡30min后,在超净工作台中抽取鼠尾中的白色肌腱,剪碎后置于0.1%的醋酸溶液中,于4℃贮存并不时摇晃,48h后取出,离心,收取上清液(即I型胶原成分),胶原蛋白含量用Lowry法测定。所得胶原溶液置于-20℃贮存。胶原经Van-Gieson法染色后呈现特征性绿色荧光。取胶原溶液、DMEM、三蒸水于冰浴中快速混合,以0.17mol/L的NaOH调pH至7.0,使胶原蛋白终浓度为1.0g/L,而DMEM则为正常细胞培养用液的1/10。快速取此胶原溶液100μl,置于48孔板中,于37℃孵育,直到完全成胶[4]。上述操作均在无菌条件下进行。
1.2　LDL的制备
    常规分离新鲜健康人空腹血清,序列超速离心分离LDL(d=1.019～1.063kg/L)[5]。整个操作过程中,密度液中均加入0.05%的EDTA防止脂蛋白氧化,加入80mg/L的庆大霉素防污染,LDL经pH7.4、0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)4℃透析后,用微孔滤膜除菌,置于4℃贮存,蛋白含量由Lowry法测定。L8-80M超速离心机及Ti80转头为美国Beckman公司产品。
1.3　ox-LDL的制备及鉴定
    LDL经pH7.4、不含EDTA的0.01mol/LPBS充分透析后,分别按Cu2+介导法和AAPH氧化法制备ox-LDL。Cu2+介导氧化反应[5]时,LDL终浓度为0.5g/L,CuCl2终浓度为40μmol/L,在特定的反应时间,用终浓度为2.7mmol/L的ED-TA终止氧化反应;而AAPH(PolysciencesInc产品)氧化[6]时,LDL终浓度为0.5g/L,AAPH终浓度为10mmol/L,于特定作用时间,用10mmol/L的抗坏血酸来终止反应。制得的ox-LDL贮于4℃,待测。取50μl(25μg)ox-LDL,加入1ml10%TCA和1ml6.7g/LTBA,充分混匀,置95℃水浴中作用30min,待冷却后于Ex515nm、Em553nm检测荧光强度,以1,1,3,3-四甲氧基丙烷(Sigma公司产品)为标准品[4]。于pH8.6的巴比妥缓冲液中进行琼脂糖凝胶电泳,天然未修饰的LDL作为基准对照相对电泳迁移率(REM:1.0),ox-LDL与LDL的实际迁移距离之比即为ox-LDL的REM[5]。
1.4　丙二醛的制备
   丙二醛(MDA)由1,1,3,3-四甲氧基丙烷酸解后获得,即:取165μl的1,1,3,3-四甲氧基丙烷与200μl浓盐酸快速混合,一分钟后加入10ml三蒸水,用1mol/L的NaOH迅速调pH至7.0,所得即为MDA。MDA的浓度由硫巴比妥酸反应物(TBARS)的方法测得[7]。将MDA加入胶原组及对照组中,观察胶原凝胶吸附MDA的情况。
结　　　果
2.1　I型胶原对LDL氧化过程中TBARS生成的影响
   LDL氧化采取两种方式诱导:Cu2+法和AAPH法,每法又分两组:对照组和胶原组。在胶原组中,部分LDL经Cu2+或AAPH负荷30min后再加入胶原凝胶,部分LDL则与胶原结合30min后再加入Cu2+或AAPH。从图1中可见,在Cu2+介导的LDL氧化过程中,对照组的潜伏期不足1h,2h后TBARS产量达到最高,为27.14μmol/g(MDA/LDL),以后TBARS值逐渐下降,并趋于平缓;而胶原组中,尽管两种加液方式有所不同,但结果却无明显差别,其潜伏期均为6～8h,TBARS的最高产率也较对照组明显降低。在AAPH氧化过程中,如图2所示,尽管胶原组的TBARS值略低于对照组,但潜伏期却较为一致,均为1h。
　　曾经报道DMEM内含多量组氨酸,具有抑制LDL氧化的作用[8]。为明确胶原凝胶中所含DMEM的可能作用,本研究还用等量的生理盐水制备凝胶,结果对Cu2+诱导的LDL氧化反应与DMEM所制凝胶无明显差异(如图3所示)。

　　进一步探讨I型胶原本身是否也会被氧化,于相同条件下分别将40μmol/LCu2+和200μl10mmol/LAAPH直接加入胶原凝胶中,经与ox-LDL同法处理后测定TBARS,发现随着时间的延长,TBARS值基本维持在一恒定水平(图4)。将制备的MDA直接加入胶原凝胶中,分别于不同时间测定TBARS含量,其变化曲线与将MDA直接加入无胶原溶液中相似,两者最大差异不超过19.3%。

讨论
   人体动脉壁存在六种不同亚型的胶原成分,其中以I型胶原含量最多。已知 、 、 和 型胶原可以与含apoB脂蛋白结合, 和 型的功能意义则不清楚。在动脉壁中,一般认为大部分的LDL结合于细胞外基质[9],当其被氧化性修饰后,与胶原结合的能力明显增强,尤其是 和 型胶原[3]。然而,在胶原存在时LDL的氧化反应敏感性如何改变则不知晓,阐明这一问题对深入探讨LDL在体内的氧化机理及其与动脉粥样硬化的关系具有重要的意义。
目前认为直接分离LDL,测定其共轭二烯的动态生成是反映LDL的氧化反应敏感性的可靠指标,然而由于胶原本身可结合大量脂蛋白,这就使该法在本研究中的应用受到极大的限制。LDL中的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应时可产生许多醛类产物,其中丙二醛(MDA)是含量最高的水溶性物质,一旦生成后可释放入周围水溶性环境中,而其他的脂溶性醛类如4羟基壬烯醛(HNE)等则于生成后仍结合于LDL,不能释至周围水性环境,因此动态地检测溶液中的MDA含量,应该成为评估LDL氧化反应的一个有用指标。我们的研究结果表明,加入定量MDA于胶原凝胶系统,用TBARS法检测,检出率为80.7%～92.8%,在12h内,与无胶原组相比,胶原组的测定值最大不低于19.3%,从而提示仅有不足1/5的MDA可能被胶原凝胶所吸附。我们以前的结果还提示,在相同实验条件下(孵育12h),约有1/4的LDL结合于胶原[10],吸附于该部分LDL上的脂质过氧化物(如HNE和烷链2,4二烯醛等)似不能为本法检出,但由于这些脂溶性产物仅占TBARS检出物的很小部分[11],因此在以后的结果分析中未予考虑该因素的作用。本研究发现当胶原存在时,Cu2+介导的LDL氧化反应潜伏期明显延长,MDA的产生量也减少,这些变化趋势与ox-LDL的REM的测定结果相一致,这就提示I型胶原的存在可能使LDL对Cu2+诱导的氧化反应敏感性降低。有报告表明IV型胶原能够被氧化修饰[12],为研究I型胶原本身是否也能参与Cu2+诱导的氧化反应,将Cu2+或AAPH加入不含LDL的胶原凝胶中,在全部实验期间内,MDA测定值均处于基线水平,表明I型胶原本身似不能产生脂质过氧化反应。另外,用DMEM或NaCl为介质分别制备凝胶,两组中ox-LDL的MDA生成值均无明显差别,从而排除了DMEM在本研究中参与抗氧化作用的可能性,这可能与本试验所用DMEM浓度仅为正常细胞培养用液的1/10有关。为进一步探讨I型胶原延缓LDL氧化反应的可能机理,应用AAPH在水溶液中产生大量自由基攻击LDL,从而诱导后者的脂质过氧化链式反应,结果可见胶原的存在对MDA的动态生成影响不大,由此推测胶原似乎不象α-生育酚、抗坏血酸等抗氧化剂那样,能直接捕获自由基,从而阻断LDL的氧化反应[13]。胶原何以能延缓Cu2+介导的LDL氧化反应的机理尚不清楚,有可能胶原与LDL的结合减少了Cu2+与LDL的作用机会,或者胶原本身也能以某种方式与Cu2+结合,从而妨碍了后者的作用。胶原延缓Cu2+介导的LDL氧化反应的病理生理学意义有待进一步阐明。一般认为胶原能促进脂蛋白在血管壁的沉积,加速LDL氧化;在中晚期As斑块,可见胶原含量增多。本研究结果则显示,I型胶原的存在使LDL对Cu2+介导的氧化反应敏感性下降,也许这更能反映活体内的情况:在体内LDL不可能单独存在,即使已经证明活体内存在ox-LDL,但其氧化程度远不及体外制备的同类物,其反应速度可能也不如在体外所见。胶原作为一种介质,其确切的作用只有在与其他介质进行详细比较后才能确定,我们的结果为深入开展这类研究提供了有用线索。