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Ｉ型胶原对ＩＩＩ型胶原基因在切口疝病人培养的成纤维细胞中的表达 |
司忠义１，ＫｌｏｓｔｅｒｈａｌｆｅｎＢ２，ＫｌｉｎｇｅＵ２，ＳｃｈｕｍｐｅｌｉｃｋＶ２
锦州医学院附属第一医院外科，辽宁 锦州 １２１０００；
切口疝是腹部手术常见长期并发症之一，其发生率为１０％至２０％。然而以前的研究通常集中在外科技术，局部解剖，疝的大小。而最近研究表明腹部动脉瘤与胶原蛋白缺陷有高度协同关系，同时也表明胶原蛋白代谢紊乱。进一步研究证实在已知的胶原蛋白代谢紊乱的疾病中合并高的疝发生率［１～３］。一些研究证明在蛋白质水平Ｉ型胶原蛋白对ＩＩＩ型胶原蛋白的比率有特征性的改变［４，５］。Ｉ型胶原蛋白和ＩＩＩ型胶原蛋白以及Ｉ型胶原蛋白对ＩＩＩ型的比率发挥一个重要调节纤维化过程和最终确定纤维束直径和结构的作用。从病理生理的观点来看Ｉ型胶原蛋白主要决定纤维的机械稳定性，ＩＩＩ型胶原蛋白行成纤细纤维，同时也被看作不成熟的愈合早期过程［６，７］。
我们研究小组曾用免疫组织化学和蛋白质印迹发现，在腹股沟斜疝和切口疝病人中Ｉ型胶原蛋白对ＩＩＩ型的比率下降，这主要由于ＩＩＩ型胶原蛋白增加所致［４，８］。虽然胶原蛋白平衡紊乱不仅在病人的皮肤，筋膜，也在腹膜组织，但是由于局部机械张力作用影响也不能排除。因此我们的研究目标是在失衡的Ｉ型胶原蛋白和ＩＩＩ型胶原蛋白的切口疝中，复发性切口疝组织中，以及在正常的癍痕培养的成纤维细胞中是否也同时存在着Ｉ型胶原蛋白和ＩＩＩ型的基因比率比率失衡。
１ 材料与方法
１.１ 临床对象
从１９９９年１月至１９９９年７月在ＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＡａｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ医学院外科住院治疗并征得本人同意的４０位病人进入研究组。皮肤组织分别来自没有皮肤手术癍痕健康对照组病人（ｎ＝１０，男性７名，女性３名，平均年龄６１岁），正常瘢痕但无疝症象病人（ｎ＝１０，男性６名，女性４名，平均年龄５８岁），切口疝病人（ｎ＝７，男性６名，女性１名，平均年龄６３岁），复发性切口疝病人（ｎ＝５，男性２名，女性３名，平均年龄６５岁）。所有的病人未接受过激素治疗和患有结缔组织疾病。
１.２ 方法
皮肤成纤维细胞的培养皮肤成纤维细胞的培养按照Ａｒａｋａｗａ［９］和Ｆｒｉｅｄｍａｎ［１０］所描述的方法进行。
１.２.１ ＲＮＡ的提取
成纤维细胞的总ＲＮＡ是用硫氰胍乙腚酸－苯芬－氯仿进行提取。试剂购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。纯化的ＲＮＡ含量用ＧｅｎｅＱｕａｎｔＩＩ（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）在２６０／２８０ＯＤ值确定并用１％琼脂电泳确定纯化的ＲＮＡ的完整性。１２２ ｃＤＮＡ的合成和ＰＣＲ总量共计５０μｌ，其中５μｇＲＮＡ，１Ｕ／μｇＤＮａｓｅ，１００ｍｍｏｌ／ｌＭｇＣｌ２和４０Ｕ／μｌＲＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒａｍｎｙ）在３７℃孵化３０ｍｉｎ。然后ＲＮＡ用异戊基乙醛，苯芬和氯仿萃取。１μｇＲＮＡ按反转录试剂盒（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）的说明书进性反转录。寡核苷酸引物序列设计按照文献发表的Ｉ和ＩＩＩ型胶原蛋白，β－Ａｃｔｉｎ序列（表１［１１］）。
单个反应体积为５０μｌ，包括１５ｍｍｏｌ／ｌＭｇＣｌ２，１ｘ嗜热ＤＮＡ聚合酶反应缓冲液，０２ｍｍｏｌ／ｌ脱氧单寡核苷酸，１２５ＵＴａｑＤＮＡ聚合酶（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ），和特异的５′端和３′引物。首先应用的ｃＤＮＡ与保守基因β－Ａｃｔｉｎ确定最佳浓度。确定ｃＤＮＡ量产生ＰＣＲ电泳带与保守基因β－Ａｃｔｉｎ产生ＰＣＲ电泳带密度一致。每组所有标本经历最初选择性的３５个循环。相同量的ｃＤＮＡ产生相同的ＰＣＲ电泳带密度，证实可重复应用［１２，１３］。最佳引物浓度被确定１μＭＩ和ＩＩＩ型胶原基因和０１μｍｏｌ／ｌβ－Ａｃｔｉｎ。ＰＣＲ过程是在ＰＣＲ反应仪（Ｐｅｒｋｉｎｇ－ＥｌｍｅｒＤＮＡＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅ，ＰｅｒｋｉｎｇＥｌｍｅｒＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｕｅｂｅｒｌｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中完成的。其过程为最初在９５°Ｃ变性２ｍｉｎ然后行ＰＣＲ循环在９５°Ｃ变性１ｍｉｎ，对Ｉ型胶原引物在５１°Ｃ退火１ｍｉｎ，对ＩＩＩ型胶原引物在４４°Ｃ退火１ｍｉｎ，然后在７２°Ｃ延伸２ｍｉｎ。Ｉ型胶原蛋白需要３５个循环，ＩＩＩ型胶原则需要４０个循环。最后所有的产物在７２℃延伸２ｍｉｎ。１％琼脂电泳分析所有的ＰＣＲ产物。用ＧｅｌＤｏｃｕｍｅｎｔ２０００（Ｂｉｏｒａｄ，ＵＳＡ）扫描记录所有电泳带，然后用ＢｉｏＲａｄ＇Ｍｕｔｉ－Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｂｉｏｒａｄ，ＵＳＡ）系统半定量方法确定各产物的量。
１.２.３ 核苷酸探针制备
应用如下人类胶原ｍＲＮＡ的核苷酸探针［１４～１５］。
Ｉ型胶原蛋白基因
（正义序列）５＇ＡＡＣＣＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴ３＇
（反义序列）５＇ＡＧＣＡＧＧＧＣＣＴＴＣＴＴＧＡＧＧＴＴ３＇
ＩＩＩ型胶原蛋白基因
（正义序列）５＇ＡＧＡＡＡＣＴＧＣＡＧＡＧＡＣＣＴＧＡＡ３＇
（反义序列）５＇ＴＴＣＡＧＧＴＣＴＣＴＧＣＡＧＴＴＴＣＴ３＇
ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）
（正义序列）５＇ＡＴＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧＡＡ３＇
（反义序列）５＇ＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＧＡＴＧＴＣＡＴ３＇上述探针用ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－１１－ｄｄＵＴＰ标记并按照地高辛核苷酸３＇端标记试剂盒（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ），然后用ｍｏｃｋｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ确定理想地高辛标记的核苷酸浓度。
１.２.４ ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ和杂交
所有标本各１０μｇＲＮＡ加入变性液５０％（ｆｏｒｍａｍｉｄｅ，２ｍｏｌｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ和１ｘＭＯＰＳ），在６５℃加热变性１０ｍｉｎ，然后放置冰上５ｍｉｎ。所有ＲＮＡ标本立即在１％的甲醛琼脂凝胶电泳，然后转移到尼龙膜上（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１７）。在１２０℃３０ｍｉｎＲＮＡ交连在该膜上。Ｉ型胶原核苷酸探针，ＩＩＩ型胶原核苷酸探针和ＧＡＰＤＨ核苷酸探针在９９℃加热变性１０ｍｉｎ，放置冰上冷却，再把热变性地高辛标记的核苷酸探加入事先予热杂交液中（Ｉ型胶原核苷酸探针在５２℃，ＩＩＩ型胶原核苷酸探针在４８℃，ＧＡＰＤＨ４１℃与尼龙膜过夜杂交。
１.２.５ 地高辛标记的ｍＲＮＡ检测
杂交后，用２ｘＳＳＣ，０１％ＳＤＳ液在室温冲洗两次，每次１０ｍｉｎ，然后用杂交温度下０１ｘＳＳＣ，０１％ＳＤＳ液轻柔晃动冲洗两次，每次２０ｍｉｎ。杂交膜在冲洗缓冲液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中平衡，然后在封闭阻断缓冲液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中室温下封闭６０ｍｉｎ。用封闭阻断缓冲液１：１００００稀释抗地高辛碱性磷酸酶并用之封闭杂交膜６０ｍｉｎ。此后用冲洗缓冲液冲洗两次，再把杂交膜放置的在检测缓冲液（１：１００稀释ＣＤＰ－ＳｔａｒＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中５ｍｉｎ。最后对Ｘ胶片进行暴光，然后用ＢｉｏＲａｄ＇Ｍｕｔｉ－Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｂｉｏｒａｄ，ＵＳＡ）对其密度进行测定。所有的结果都与ＧＡＰＤＨ密度进行标化。
１.２.６ 统计分析
统计分系应用ＳｔａｔｉｓｔｉｃａｌＰａｃｋａｇｅｆｏｒＳｏｃｉａｌＳｃｉｅｎｃｅ４０（ＳＰＳＳ４０）软件进行分系。用单变量方差分系来确定组间差别。所有数据用均数±标准差来表达。
２ 结 果
１％琼脂电泳检查所有ＲＮＡ标本的完整性。完整的核糖体ＲＮＡ的２８Ｓ对１８Ｓ比率在溴化乙锭染色下大致应为２：１。我们的结果表明在ＲＮＡ提取过程中没有ＲＮＡ降解（图１）。图像密度扫描仪用于确定保守基因（β－Ａｃｔｉｎ在３５个循环和４０个循环是否是相同地表达。（β－Ａｃｔｉｎ表达如图２所示。在３５个循环和４０个循环中电泳带变异应小于１０％。
２.１.Ｉ和ＩＩＩ型胶原ｍＲＮＡ在ＲＴ－ＰＣＲ中的表达
Ｉ型胶原基因和ＩＩＩ型胶原基因（图３）在切口疝病人的成纤维细胞中经与（β－Ａｃｔｉｎ的ｍＲＮＡ基因标化后测得相对各基因含量。Ｉ型胶原基因在健康对照组中的成纤维细胞中的量为０４３±００１，在成熟癍痕组的成纤维细胞中的量为０.５４±０.０２，在切口疝病人组中成纤维细胞中的量为０.９０±０.０４，在复发性切口疝病人成纤维细胞中的量为１.１９±０.０４。总体来说，ＩＩＩ型胶原基因表达是升高的，在健康对照成纤维细胞组中量为１７２±０.０３，在成熟癍痕组的成纤维细胞中的量为２.２９±０.０４，在切口疝病人组中的成纤维细胞组中量为４.１３±０.０４，在复发性切口疝病人成纤维细胞中的量为６.０２±０.０３。在这个研究中Ｉ型胶原基因对ＩＩＩ型胶原基因的比率也被测定，在健康对照成纤维细胞组为０.２５±０.０８，在成熟癍痕成纤维细胞组的比率为０.２５±０.０１，在切口疝病人组中的成纤维细胞组中比率为０.２２±０.０８，在复发性切口疝病人组的成纤维细胞中的比率为０.２０±０.０７。在所有病人组中，复发性切口疝病人组与对照组的比率下降最为明显（Ｐ＜０.０１），与成熟癍痕组为显著（Ｐ＜０.０１），甚至对切口疝病人组（Ｐ＜０.０１）。对照组和成熟癍痕组之间无显著差异（Ｐ＞０.０５）。
２２ ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ分析Ｉ型胶原，ＩＩＩ型胶原和ＧＡＰＤＨｍＲＮＡ的ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ结果如图４所示。Ｉ型胶原ｍＲＮＡ（５８ｋｂ）和ＩＩＩ型胶原ｍＲＮＡ（５４ｋｂ）含量经与保守基因ＧＡＰＤＨｍＲＮＡ（１９ｋｂ）标化测定。然后Ｉ型胶原ｍＲＮＡ含量对ＩＩＩ型胶原ｍＲＮＡ含量的比率被计算出。标化后的相对的Ｉ型胶原ｍＲＮＡ在健康对照成纤维细胞组含量为０.５１±０.０３，在成熟癍痕组的成纤维细胞中的量为０.５５±０.０２，在切口疝病人组成纤维细胞的量为０.７９±０.０３，在复发性切口疝病人成纤维细胞中的量为２０±０.０３。相应地标化后的ＩＩＩ型胶原ｍＲＮＡ在健康对照成纤维细胞组含量为１.０３±０.０３，在成熟癍痕组成纤维细胞中ｍＲＮＡ的量为１.１１±０.０２，在切口疝病人组成纤维细胞ｍＲＮＡ的量为１.８０±０.０３，在复发性切口疝病人成纤维细胞中ｍＲＮＡ的量为５.６１±０.０３。Ｉ型胶原ｍＲＮＡ对ＩＩＩ型胶原ｍＲＮＡ比率被计算出来。对照组为０.５１±０.０１，成熟癍痕组０.５０±０.０１，两组之间无显著差异（Ｐ＞０.０５）。相反，在切口疝病人组０.４４±０.０１和复发性切口疝病人组０.３６±０.０２是明显下降的（Ｐ＜０.０１）。
３ 讨 论
我们以前的研究表明无论在初发和复发疝的皮肤和筋膜组织中ＩＩＩ型胶原蛋白较Ｉ型胶原蛋白增加［４，８］。这个结果提示聚集增加的胶原蛋白可能是由于系统性代谢紊乱的结果。虽然多种因素参与疝的形成，但是生物学因素，尤其细胞外基质被认为也参与这个过程的形成。作为细胞外基质主要成份的胶原蛋白绝大部分由Ｉ和ＩＩＩ型胶原蛋白构成［５］，Ｉ型胶原蛋白具有高韧性，而ＩＩＩ型胶原蛋白具有柔韧性。ＩＩＩ型胶原纤维比Ｉ型胶原纤维纤细，广泛分布于具有一定程度柔韧性和弹性的组织。在愈合早期ＩＩＩ型胶原纤维发挥关键作用，但是ＩＩＩ型胶原纤维并不明显决定伤口愈合张力，因而在愈合早期癍痕组织富有弹性。已证实在幼稚肉芽和癍痕极其富含ＩＩＩ型胶原，而Ｉ型胶原含量非常少，相应的Ｉ型胶原对ＩＩＩ型胶比率是下降的。然而几天后最初占优式ＩＩＩ型胶原逐渐消失，相反Ｉ型胶原占优势，组织强度随之而增加［７］。Ｉ型胶原和ＩＩＩ型胶原共同存在一个纤维中，它们的比率在调节纤维化过程中发挥重要作用并决定纤维直径和纤维束的结构。
一般而言，在组织愈合过程中结缔组织蛋白质合成是减少的。在组织重构和成熟过程中胶原纤维在规模上是增加，反映了在胶原比率的改变和Ｉ型胶原，ＩＩＩ型胶原聚合过程的改变。在该过程中原有的组织的机械强度逐渐恢复。在正常皮肤中Ｉ型胶原蛋白和ＩＩＩ型胶原蛋白大约为４：１［６］。研究表明，培养的皮肤成纤维细胞数量在股沟斜疝比正常对照明显增加［５］，同时也是第一次揭示了Ｉ型胶原ｍＲＮＡ对ＩＩＩ型胶原ｍＲＮＡ的比率在切口疝较在正常皮肤和成熟的癍痕中明显下降。这上升的ＩＩＩ型胶原ｍＲＮＡ的表达与在切口疝病人的增加的ＩＩＩ型胶原蛋白积聚是相一致的。这些研究结果表明α１（ＩＩＩ）型前胶原基因的转录可能增强在切口疝病人ＩＩＩ型胶原产量。令人感兴趣的是，这种差别在复发切口疝病人是更加显著。这些发现提示已观察到的胶原积累是由于系统性胶原代谢性紊乱所至。另外，在腹股沟斜疝病人纤维细胞比正常皮肤纤维细胞中也存在α１（ＩＩＩ）型胶原增加［５］。这个研究第一次揭示了在切口疝病人比成熟癍痕和正常健康皮肤的纤维细胞中Ｉ型胶原对ＩＩＩ型胶原ｍＭＲＮＡ比率明显下降。升高的ＩＩＩ型胶原对Ｉ型胶原与这个升高的ＩＩＩ型胶原对Ｉ型胶原ｍＲＮＡ在切口疝病人是一致的［８］。一些其他疾病，包括肝纤维化，癍痕疙瘩，扩张性心肌病特征是组织纤维化和过多胶原沉积［４］。成纤维细胞合成胶原增加被推测为既是基因转录的增加又可能ｍＲＮＡ翻译的增加，或者胶原降解的减少。进一步研究表明，在癍痕疙瘩和进行性系统性硬化症存在胶原增加而并非降解减少［１０］。以前的研究表明在切口疝病人组织中ＩＩＩ型胶原含量增加［８］，而现在的培养的成纤维细胞研究具有ＩＩＩ型胶原对Ｉ型胶原ｍＲＮＡ比率增加，表明是刺激转录的结果。因此ＩＩＩ胶原合成增多。故在培养的成纤维细胞确定胶原ｍＲＮＡ的量可以确定原始基因紊乱并反驳由于在疝组织机械张力的直接造成的疝发生的结果。这个研究提示ｍＲＮＡ稳定性的调节和基因转录调节是重要的调节胶原净含量机制。大多发表的文章在体内的实验已清楚地表明组织中胶原ｍＲＮＡ和相应的胶原含量积累间存在着强烈的相关关系［７］。这与我们的研究成果是一致的，表明改变Ｉ型胶原对ＩＩＩ型胶原的比率也可被看作ＩＩＩ型胶原对Ｉ型胶原ｍＲＮＡ比率相对增加。因为我们的研究既没有揭示基因的拷贝数目改变又没有检测局部基因缺陷，因而进一步深入阐明复杂化的创伤愈合过程的研究是必要的。然而从我们的数据来看，在切口疝病人成纤维细胞转录前机制功能上调节胶原合成。
另外，其他危险因素，如感染，年龄，性别，切口的类型，或者技术上的缺陷，但我们的数据强烈地提示有着改变的物理特性的，含量增加ＩＩＩ型胶原的个体可能倾向于切口疝的发生，尤其复发性切口疝发生。相应地，胶原代谢紊乱作为切口疝发生的基本原因将可以解释临床的疑惑，不同的缝合方法导致不同的临床结果。这有助于理解高复发率在重复缝合腹部切口作为这最初的技术缺陷。将来在癍痕疝病人组织中胶原基因表达和调节调查研究可以确定人群的风险性。因为切口疝是腹部手术最常见的长期的并发症高达２０％，所以任何一个预防治疗战略将考虑到社会和经济适应性，效益性。
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