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ＨＳＰ４７在ＴＧＦ-β１诱导肝星形细胞合成Ｉ型胶原蛋白中的作用 |
李 异１，吴 畏２，蒋永芳１，王慷慨３
（中南大学
１．湘雅二医院肝脏病研究中心，长沙４１００１１；
２．湘雅医院普外科，长沙４１０００８；
３．湘雅医学院病理生理学系，长沙４１００７８）
肝纤维化是由肝细胞的损伤以及相继发生的炎症反应所启动，结果不仅导致细胞外基质（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘ，ＥＣＭ）的堆积，还使ＥＣＭ成分发生永久的分子和组织结构的重新分布，从而出现严重临床并发症［１２］。肝脏星状细胞（ｈｅｐａｔｉｃｓｔｅｌｌａｔｅｃｅｌｌ，ＨＳＣ）的激活是肝纤维化形成过程中的关键［３］。ＨＳＣ激活的详细机制尚不完全清楚，但已知有许多细胞因子、ＥＣＭ及一些氧化活性产物参与激活ＨＳＣ的调控，而ＴＧＦβ是最重要的促ＨＳＣ活化因子之一［４５］。热休克蛋白４７（ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ４７，ＨＳＰ４７，又称ｃｏｌｌｉｇｉｎ）是一种能与多种类型胶原和前胶原特异性结合的内质网蛋白质，被认为是胶原特异性分子伴侣，与胶原合成密切相关，可能在器官纤维化过程中起重要作用［６７］。近年来研究发现ＨＳＰ４７参与肾纤维化疾病的形成过程并可成为肾纤维化防治的目标之一［８］。尽管如此，ＨＳＰ４７对ＥＣＭ的合成有何影响目前尚不清楚。本研究通过热休克预处理方法诱导ＨＳＰ４７表达，同时采用反义寡核苷酸技术抑制ＨＳＰ４７表达，观察ＨＳＰ４７的表达变化对Ⅰ型胶原蛋白合成的影响，以期明确ＨＳＰ４７在ＥＣＭ合成过程中的作用及其对肝纤维化进程的影响。
１ 材料与方法
１．１ 材料
ＨＳＣＴ６细胞株购自中南大学生殖中心细胞库；ＲＰＭＩ１６４０完全培养基，无支原体新生小牛血清购自美国Ｇｉｂｃｏ公司；ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００转染试剂盒购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；重组人ＴＧＦβ１购自美国ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ公司，羊抗Ⅰ型胶原蛋白和ＨＳＰ４７多克隆抗体、兔抗ＧＡＰＤＨ多克隆抗体购自美国ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司；兔抗βａｃｔｉｎ多克隆抗体购自美国Ｒ＆Ｄ公司；辣根过氧化物酶标记的兔抗羊、羊抗兔ＩｇＧ及ＤＡＢ显色试剂盒购自武汉博士德生物工程公司。ＨＳＰ４７反义寡核苷酸由上海博亚生物技术公司人工合成（ｓｅｎｓｅ：５′ＣＡＴＧＣＧＣＴＣＣＣＴＣＣＴＧＣＴＴＣ３′；ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：５′ＧＡＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＡＧＣＧＣＡＴＧ３′）。
１．２ 方法
１．２．１ 细胞培养及处理
ＨＳＣＴ６细胞用含１０％新生小牛血清、１００μｇ／ｍＬ链霉素、１００μｇ／ｍＬ氨苄青霉素的ＲＰＭＩ１６４０完全培养基调整为１×１０６／ｍＬ后接种于细胞培养瓶，２４ｈ后用于实验。依据Ｂｒｏｗｎ等［９］的报道，采用终浓度为１ｎｇ／ｍＬ和１０ｎｇ／ｍＬ的ＴＧＦβ１处理培养的ＨＳＣＴ６细胞２４ｈ。热休克反应（ｈｅａｔｓｈｏｃｋｒｅｓｐｏｎｓｅ，ＨＳＲ）采用４２℃循环水浴中孵育１ｈ，３７℃分别恢复６ｈ，１２ｈ，２４ｈ，４８ｈ。
１．２．２ 免疫印迹分析
用２×ＳＤＳ加样缓冲液裂解细胞，收集蛋白质，采用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法进行蛋白定量，制备好的蛋白样品置－８０℃冰箱保存备用。每泳道以２０μｇ或４０μｇ蛋白上样，经ＳＤＳＰＡＧＥ后，电转膜至硝酸纤维膜。室温封闭３ｈ后加入一抗，室温孵育１ｈ，加入ＨＲＰ标记的二抗孵育３０ｍｉｎ，ＤＡＢ显色，拍摄照片，记录实验结果。同时检测ＧＡＰＤＨ，作为上样对照。
１．２．３ 免疫印迹条带的灰度扫描及其定量分析
用Ｂａｎｄｌｅａｄｅｒ３．０软件对免疫印迹条带进行灰度扫描，按下述公式分别计算３次试验中某蛋白的相对含量：蛋白相对含量＝（该蛋白条带的灰度值－背景的灰度值）／（上样对照条带的灰度值－背景的灰度值），以此比值计算均数与标准差。
１．２．４ 细胞活力检测
采用黄柏英等［１０］所用ＭＴＴ法检测反义寡核苷酸对细胞的毒性作用。取对数生长期细胞接种于９６孔板（１×１０４／孔）在含１０％新生小牛血清的条件下培养１２ｈ，分别转染反义寡核苷酸、正义寡核苷酸２μｇ／孔，于２４ｈ及４８ｈ向每孔中加入ＭＴＴ（５ｍｇ／ｍＬ）２０μＬ继续培养４ｈ，结束时，倾弃培养液上清，加入二甲基亚砜１００μＬ，于３７℃振荡至紫色的甲肷结晶完全溶解后，将９６孔板放入酶标仪，测量５７０ｎｍ处吸光值。统计分析以正常对照组光密度值为１，其余各组分别与之相比后再计算均数与标准差。
１．２．５ 脂质体介导的寡核苷酸转染
根据美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司提供的转染操作说明书及彭创等［１１］建立的方法进行。用０．２５ｍＬ含血清及抗生素（下同）的ＲＰＭＩ１６４０培养基溶解２０μｇ合成的寡核苷酸，并将其与０．２５ｍＬ含１５μＬ脂质体的无血清ＲＰＭＩ１６４０培养基充分混匀，室温放置２０ｍｉｎ。细胞用无血清ＲＰＭＩ１６４０培养基洗涤３遍后，加入１．５ｍＬ无血清ＲＰＭＩ１６４０培养基，然后加入上述寡核苷酸与脂质体的混合物，３７℃，５％的ＣＯ２培养箱中培养，６ｈ后再加入２ｍＬ含２０％小牛血清的ＤＭＥＭ／ＲＰＭＩ１６４０培养基，于２４ｈ后收集细胞，进行后续实验。
１．３ 统计学处理
采用“简明医学统计学处理系统１．０”软件进行统计学分析。数据以均数±标准差（珋ｘ±ｓ）表示，两组间比较用ｔ检验，多组间比较用单因素方差分析。以Ｐ＜０．０５判断为有统计学意义。
２ 结 果
２．１ ＴＧＦβ１对ＨＳＣＴ６细胞ＨＳＰ４７和Ⅰ型胶原蛋白表达的影响 免疫印迹结果显示，在正常培养的ＨＳＣＴ６细胞中，有一定量的ＨＳＰ４７和Ⅰ型胶原蛋白表达（图１Ａ）。当用重组人ＴＧＦβ１蛋白１ｎｇ／ｍＬ和１０ｎｇ／ｍＬ分别处理ＨＳＣＴ６细胞２４ｈ后，Ⅰ型胶原蛋白的表达逐渐增加，并呈现剂量依赖效应。对Ⅰ型胶原蛋白和ＧＡＰＤＨ印迹条带进行灰度分析显示，１０ｎｇ／ｍＬＴＧＦβ１处理后，Ⅰ型胶原蛋白条带与ＧＡＰＤＨ条带的灰度比值显著高于１ｎｇ／ｍＬＴＧＦβ１处理组和正常对照组（Ｐ＜０．０１，图１Ｂ）。用ＴＧＦβ１蛋白１ｎｇ／ｍＬ和１０ｎｇ／ｍＬ分别处理ＨＳＣＴ６细胞２４ｈ后，ＨＳＰ４７表达亦明显增加，其灰度比值与正常对照组相比，具有统计学差异（Ｐ＜０．０５）。
２．２ 热休克反应对ＨＳＰ４７及Ⅰ型胶原蛋白表达的影响 免疫印迹结果显示，热休克反应恢复培养１２ｈ，ＨＳＣＴ６细胞中ＨＳＰ４７蛋白表达显著增加，并维持其高表达状态至恢复培养４８ｈ（图２Ａ）。对ＨＳＰ４７蛋白和ＧＡＰＤＨ印迹条带进行灰度分析显示，热休克反应恢复培养１２～４８ｈ，ＨＳＰ４７蛋白条带与ＧＡＰＤＨ条带的灰度比值显著高于正常对照组（Ｐ＜０．０１，图２Ｂ）。热休克反应后恢复６～４８ｈ，Ⅰ型胶原蛋白的表达未见明显改变。
２．３ 热休克反应对ＴＧＦβ１诱导Ｉ型胶原蛋白表达的影响 免疫印迹结果显示：热休克处理恢复培养２４ｈ后再用ＴＧＦβ１处理２４ｈ，ＨＳＣＴ６细胞中Ｉ型胶原蛋白的表达显著高于未经热休克处理的细胞（图３Ａ），而且仍然呈现剂量依赖效应。对Ⅰ型胶原蛋白和βａｃｔｉｎ印迹条带进行灰度分析显示，热休克反应后，Ⅰ型胶原蛋白条带与βａｃｔｉｎ条带的灰度比值显著高于未经热休克处理的细胞（图１Ａ，Ｐ＜０．０１），且这种比值对ＴＧＦβ１呈现剂量依赖关系，即１０ｎｇ／ｍＬＴＧＦβ１处理组高于１ｎｇ／ｍＬＴＧＦβ１处理组（Ｐ＜０．０５）。
２．４ ＨＳＰ４７反义寡核苷酸对ＴＧＦβ１诱导Ｉ型胶原蛋白表达的影响 ＭＴＴ法检测细胞存活力显示：细胞经热休克处理恢复培养１２ｈ后，细胞基本恢复正常，细胞存活力与正常未处理细胞存活力相比，无统计学差异（Ｐ＞０．０５）；热休克处理恢复培养１２ｈ的细胞再经脂质体导入ＨＳＰ４７正义及反义寡核苷酸探针２４ｈ，细胞存活力均数略低于正常未处理组及ＨＳＲ处理组细胞，但并无统计学差异（Ｐ＞０．０５）（图４Ａ）。免疫印迹检测及灰度分析显示，ＨＳＰ４７反义寡核苷酸探针明显抑制了热休克反应所诱导的ＨＳＰ４７表达水平，而其正义寡核苷酸探针对热休克反应所诱导的ＨＳＰ４７表达水平没有影响（图４Ｂ，Ｃ）。
进一步采用免疫印迹检测ＴＧＦβ１诱导Ｉ型胶原蛋白表达显示：反义寡核苷酸在废除热休克反应诱导的ＨＳＰ４７表达后，亦能显著抑制ＴＧＦβ１诱导的Ｉ型胶原蛋白表达，而正义寡核苷酸对此没有影响（图５Ａ），灰度分析显示，反义寡核苷酸处理组与单纯热休克反应组及正义寡核苷酸处理组相比具有统计学差异（Ｐ＜０．０１）（图５Ｂ）（图略）。
３ 讨 论
在慢性损伤及炎症刺激下，ＨＳＣ的表型由一般状况时的静止状态激活并向肌纤维母细胞转化，分泌大量ＥＣＭ，构成肝纤维化发生、发展的重要基础［１２］。研究表明，ＨＳＣ的活化及表型转化与ＴＧＦβ１密切相关。ＴＧＦβ１能促进体外培养的静态ＨＳＣ向肌纤维母细胞转化［１３］。此外，ＴＧＦβ１能促进ＨＳＣ合成大量的胶原（尤其是Ⅰ型胶原）、纤黏连蛋白和基质黏多糖蛋白，并促进ＥＣＭ渗入基质中［１４］。本研究以ＨＳＣＴ６细胞株为研究对象，发现１ｎｇ／ｍＬ和１０ｎｇ／ｍＬＴＧＦβ１均能诱导ＨＳＣＴ６细胞合成Ⅰ型胶原。ＨＳＰ４７广泛存在于从鸡、鼠到人的许多物种。作为一种胶原特异性的分子伴侣蛋白，可以与前胶原蛋白结合，从而稳定前胶原蛋白单体，防止其聚集形成寡聚体［６］。本研究发现ＴＧＦβ１在诱导Ⅰ型胶原合成的同时，也可使ＨＳＰ４７的表达上调。这一结果与Ｓａｓａｋｉ等［１５］的发现一致。进一步发现热休克反应可以诱导ＨＳＣＴ６细胞中ＨＳＰ４７高表达，但热休克反应并不能促进Ⅰ型胶原合成。
基于ＨＳＰ４７是一种胶原特异性的分子伴侣蛋白，笔者设想ＨＳＰ４７的高表达是否能促进ＴＧＦβ１诱导的Ⅰ型胶原合成。结果发现，在ＴＧＦβ１的诱导下，热休克反应处理的ＨＳＣＴ６细胞中Ⅰ型胶原合成显著多于未经热休克反应的ＨＳＣＴ６细胞所合成的Ⅰ型胶原。这一结果提示ＨＳＰ４７的高表达促进了ＴＧＦβ１诱导的胶原蛋白合成，因此我们进一步考虑人为下调ＨＳＰ４７表达，是否能降低ＴＧＦβ１诱导的胶原蛋白合成。笔者人工合成了ＨＳＰ４７的反义寡核苷酸，并采用脂质体转染技术将其导入热休克反应后的ＨＳＣＴ６细胞。结果显示这一反义寡核苷酸探针能有效抑制ＨＳＰ４７的表达，基本废除了热休克反应所诱导的ＨＳＰ４７表达。同时ＭＴＴ法检测显示此时细胞存活力和正常时无明显差异，因此ＨＳＰ４７表达下调并非由于细胞死亡导致细胞数目不等所引起。进一步检测Ⅰ型胶原蛋白的表达发现，反义寡核苷酸显著抑制了ＴＧＦβ１诱导的Ⅰ型胶原蛋白合成。本研究结果提示：ＨＳＰ４７在Ⅰ型胶原蛋白的合成中发挥重要作用，显著降低ＨＳＣＴ６细胞内ＨＳＰ４７的表达，可有效地抑制ＴＧＦβ１诱导的Ⅰ型胶原蛋白合成。尽管本研究仅观察了Ⅰ型胶原蛋白表达的改变，并不能推及所有ＥＣＭ合成都受到ＨＳＰ４７的调控，但Ⅰ型胶原蛋白是ＥＣＭ中的主要成分之一，结合近年来国内外的研究结果，笔者仍可设想ＨＳＰ４７是一种比较理想的抗纤维化治疗的分子靶。 |
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