向定成 杨传虹 何建新 赖晃文 龚志华 易绍东 邱建
早期的动物实验研究表明,在合适的剂量范围内血管内放射治疗可以降低血管内膜增生程度[1]。初步的小规模临床研究亦显示,血管内放射治疗有可能是继支架之后另一降低再狭窄率的有效技术[2,3]。但对血管内放射治疗抑制内膜增生的相关机制的研究,尤其是对血管壁细胞外基质影响的研究目前尚较少。最近有作者分别从动物实验及临床发现,血管内放射治疗因延迟损伤愈合而导致后期血栓形成。因此,对血管内放射治疗的基础研究尚有待深入。本研究旨在探讨血管内放射治疗对血管成形术后Ｉ型胶原动态演变的影响。
材料与方法
1.动物准备及放射治疗:国产Ｉ号小型猪6头,月龄6个月,体重23～25ｋｇ,标准高脂高胆固醇饮食饲养4周,最后3ｄ开始添加肠溶阿司匹林300ｍｇ/ｄ。然后进行第一次血管损伤,切开右侧颈动脉放置7Ｆ动脉鞘,经鞘内注射肝素钠6250Ｕ,用过大球囊(血管与球囊直径比为1∶1 3)成形术加去内皮方法进行双侧髂内、外动脉血管内膜损伤(损伤血管数ｎ=24)。术后继续喂高脂高胆固醇饮食,16周后按上述方法切开左侧颈动脉进行双侧髂动脉造影及球囊成形术,术中每只动物按随机表法随机选择一侧髂内或髂外动脉作为放射治疗目标血管(放疗组ｎ=6)。根据主动脉弓及左右髂动脉分叉角度预先将后装机输源管远端塑形,Ｘ线透视下将输源管远段送达并精确定位于成形术的目标血管,接放射治疗后装机,系统自动导入192Ｉｒ放射源(放射源规格0 7×3 5ｍｍ,活度13 88Ｃｉ)进行血管内照射,设定照射剂量20～25Ｇｙ,照射血管段长度控制为20ｍｍ。其余扩张血管作为对照组(ｎ=18)。术后停止高脂高胆固醇饮食,分别于成形术后12周(动物数ｎ=3)及24周(动物数ｎ=3)处死动物,取材后将目标血管每间隔3ｍｍ切成小段,取1段迅速投入液氮冷藏,冰冻切片用于ｍＲＮＡ原位杂交;其余血管用中性甲醛液固定,石蜡包埋后作5μｍ厚度连续切片,每间隔3ｍｍ血管段取1张切片分别作各种抗体的免疫组化。
2.免疫组化染色:采用链酶亲和素过氧化物法,按常规免疫组化操作步骤染色,ＤＡＢ显色。设不加一抗的阴性对照,为便于定量分析,阴性对照与阳性染色取自相邻切片。
3.ｍＲＮＡ原位杂交:采用地高辛标记的Ｉ型胶原α1链寡核苷酸探针(长度73ｂｐ),按文献[4]介绍方法进行ｍＲＮＡ原位杂交,显色剂及阴性对照同免疫组化。
4.免疫组化和原位杂交结果定量分析:按作者报道的方法[5]在ＩＢＡＳ2000型计算机辅助图像处理系统上进行定量分析,输出结果以相对染色密度指数( ｘ±ｓ)表示。
5.统计学处理:组间比较用ｔ检验。
结果
12周及24周时Ｉ型胶原蛋白及ｍＲＮＡ表达量放疗组均显著低于对照组(Ｐ<0 01);金属蛋白酶 1(ＭＭＰ 1)在12周时放疗组略低于对照组(Ｐ<0 05),但到24周时两组间无明显差异(Ｐ>0 05);而组织型金属蛋白酶 1抑制剂(ＴＩＭＰ 1)在12周和24周时放疗组均显著低于对照组(Ｐ<0 01);ＴＩＭＰ 1/ＭＭＰ 1比值在12周和24周时放疗组均显著低于对照组。此外,24周对照组Ｉ型胶原蛋白及ｍＲＮＡ表达水平均显著高于12周对照组,24周对照组ＭＭＰ 1的活性亦显著高于12周对照组,但ＴＩＭＰ 1的活性无显著变化。而24周放疗组Ｉ型胶原ｍＲＮＡ表达量较12周放疗组下降,但Ｉ型胶原蛋白总量无显著变化,与此同时,24周放疗组ＭＭＰ 1活性较12周放疗组增高,但ＴＩＭＰ 1活性降低。放疗组和对照组ＴＩＭＰ 1/ＭＭＰ 1比值在24周时均显著低于12周时(表1)。
讨论
1.192Ｉｒ血管内放射治疗对血管成形术后Ｉ型胶原的影响:细胞外基质重建是血管成形术后后期再狭窄发生的主要病理基础,而Ｉ、ＩＩＩ型胶原是血管壁的主要基质成分,192Ｉｒ血管内照射显著降低了血管成形术后12周和24周时血管壁Ｉ型胶原的ｍＲＮＡ表达和细胞外Ｉ型胶原蛋白的聚集。说明在该剂量范围内,192Ｉｒ血管内照射能通过降低细胞外Ｉ型胶原量而影响血管成形术后后期血管壁重建,从而具有预防再狭窄的作用。
2.192Ｉｒ血管内放射治疗影响Ｉ型胶原代谢的作用机制:胶原代谢包括胶原合成和分解,决定Ｉ、ＩＩＩ型胶原在血管壁细胞外聚集量的主要因素是细胞合成胶原多少以及ＴＩＭＰ 1和ＭＭＰ 1的活性。其中ＭＭＰ 1是降解Ｉ型胶原的主要金属蛋白酶,而ＴＩＭＰ 1则抑制其活性。ＴＩＭＰ 1/ＭＭＰ 1的比值是决定胶原分解代谢的主要因素。比值越大,胶原分解越少;比值越小,分解越多。本研究放疗组Ｉ型胶原ｍＲＮＡ均显著低于对照组,而ＴＩＭＰ 1/ＭＭＰ 1比值放疗组亦显著小于对照组,说明192Ｉｒ照射既可抑制Ｉ型胶原合成,同时亦可增加其降解,因而使Ｉ型胶原的聚集量明显降低。至于放射治疗影响ＴＩＭＰ 1和ＭＭＰ 1活性的机制尚待进一步研究。此外,从24周和12周的相应组别的比较结果可见,24周对照组Ｉ型胶原ｍＲＮＡ的表达量较12周时仍呈增加趋势,说明在血管成形术后24周Ｉ型胶原的分泌仍很活跃,提示预防再狭窄是血管成形术后的长期任务。而在放疗组,Ｉ型胶原ｍＲＮＡ表达量在24周时较12周时明显降低,说明192Ｉｒ血管内放射治疗在抑制Ｉ型胶原表达量的同时可以使其分泌高峰提前。此特点可能与192Ｉｒ放射治疗影响了血管平滑肌等细胞表型特征有关,使血管平滑肌细胞提前由合成型转化为收缩型,随之其合成和分泌胶原的活性降低。
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