王丽平， 史晓丽， 江善祥
（南京农业大学动物医学院，江苏 南京 210095）
硫酸粘杆菌素，又称硫酸抗敌素、硫酸粘菌素、硫酸多粘菌素 E，是从多粘芽胞杆菌（Bacillus polymyxa）的培养液中提出的一种碱性多肽类抗生素，对革兰氏阴性杆菌如大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌等有强大的抗菌作用，对绿脓杆菌作用尤其突出，细菌对本品不易产生耐药性，因内服不易吸收，兽医临床上常用于口服给药治疗动物肠道细菌感染，或可作为饲料添加剂，促进畜禽的生长和提高饲料的利用率。日本、美国和欧共体均批准该药作为兽药使用，我国于 1986 年批准日本旭化成工业株式会社的产品进口国内市场，反映良好。但多年来，该药一直依赖于进口，为改变该现状，国内部分兽药厂家正致力于该药的研究。现山东鲁抗已生产出该药，并已进行了药效学方面的研究，但有关国产药毒理学研究尚未报道，为此，我们对该药进行了急性毒性、微核试验及精子畸形试验，旨为该药的毒理学评价提供依据。
1 材料与方法
1.1 动物
昆明种小白鼠，雌雄各半，体重 18～22 g，由江苏省中医药大学实验动物中心提供。
1.2 药品及试剂
硫酸粘杆菌素：山东鲁抗提供，效价 22 000 U/mg。环磷酰胺：上海华联制药有限公司生产，批号：010706。吉姆萨染色液、甲醇（分析纯）、甘油（分析纯）、小牛血清、生理盐水、PBS 缓冲液，2 % 伊红染色液，均由南京农业大学动物医学院药理组提供。
1.3 试验方法
1.3.1 硫酸粘杆菌素 LD50的测定 昆明种小白鼠 50 只，随机分为 5 组，进行内服染毒，最大剂量为 1 200 mg/kg，最小剂量为 578 mg/kg，观察记录两周内动物出现的毒性反应及死亡数，按改良寇氏法[1]计算 LD50及 95 % 的可信限。
1.3.2 微核试验 分组与给药：小鼠 100 只，随机分为 5 组，染毒前禁食 4～8 h，染毒方式及剂量如表 1 所示。
骨髓液的制备和涂片：试验组分别于给药后 24、36、48、72 及 96 h 采样，阳性对照组于给药后 36、48 h 采样，阴性对照组于 24 h 采样，各取 4 只小鼠，按常规方法[1]制备骨髓细胞液，涂片、固定及染色，每鼠制片 3 张。
观察计数：先在低倍镜下进行观察，选择分布均匀，染色较好的区域，再在油镜下观察计数，双盲法计数分析，每张片计数 1 000 个 PCE 细胞，各时间点所采样品均观察 6 张片，计数其中的微核数，求出微核千分率，按小鼠骨髓 PCE 微核统计法进行统计分析。统计结果差异显著（P<0.05），并有剂量反应关系时判为阳性，反之则为阴性。同时还应计数200 个细胞中嗜多染红细胞（PCE）与正染红细胞之比（PCE/NCE），以观察细胞毒性作用概况。
1.3.3 精子畸形试验 分组与给药：小鼠 50 只，称重后随机分为 5 组，每组 10 只动物，染毒方式及剂量，如表 2 所示。
精子悬液制备及制片：首次给药后 35 d，颈椎脱臼处死小鼠，取两侧附睾，用眼科剪纵向剪开，置于装有 0.2 mL 2 % 伊红溶液的小试管中，用吸管吹气于管底 30～40 次，使精子从附睾中充分游离出来，静置染色 5 min，摇匀，吸取精子悬液滴于清洁玻片上，推片晾干，甲醇固定 5 min，镜检计数，每鼠制片 3 张。最高剂量组小鼠死亡 3 只，中剂量组死亡2 只，阳性对照组死亡 1 只，故各剂量组取 5 只小鼠制片。
阅片：每只小鼠检查完整的精子 400 条，每个剂量组检查 6 000 条精子，按无钩、无定形、香蕉形、胖头和双头双尾分别记录畸形精子数及总的精子畸形百分率，各剂量组的精子畸形率与阴性对照组之间的差异分析采用 t–检验，若各剂量组与阴性对照组有显著性差异且有剂量反应关系时，可判断试验结果为阳性。
2 结果
2.1 硫酸粘杆菌素的急性毒性
大约在染毒 2 h后最大剂量组的小鼠开始出现不安、跳跃、呼吸急促，随后在几分钟内便死亡，其它剂量组小鼠仅见精神不振、反应迟钝、闭眼伏地、不食等症状，2～3 d 后有个别死亡，试验结果用改良寇氏法的公式计算，得出待测硫酸粘杆菌素的径口 LD50 为711.54 mg/kg，其 95 % 可信限为 805.01～628.93 mg/kg，按外来化合物毒性分级标准判断，硫酸粘杆菌素属低毒类物质。
2.2 硫酸粘杆菌素对小鼠骨髓细胞的微核效应
2.2.1 小鼠骨髓细胞 PCE 与 NCE 比值 结果表明，阴性对照组、阳性对照组、及硫酸粘杆菌素各剂量组 PCE 与 NCE 比值均在正常范围内（0.6～1.2）[2]，说明 PCE 形成未受抑制，受试物在该剂量下，无细胞毒作用，可排除该因素对微核计数所造成的影响，故结果是可靠的（见表 3）。
2.2.2 小鼠骨髓微核检出率 表中结果表明，各用药组与阴性对照组在各时间点相比较，均无显著性差异（P＞0.05），各时间点用药组与阳性对照组比较，差异极显著（P<0.01）；各用药组之间无显著差异（P＞0.05），这说明试验药品的微核率与剂量之间不存在明显的量效反应关系，且各剂量组在不同时间点的微核率也无显著性差异（P＞0.05），结果可判为阴性，表明硫酸粘杆菌素对小鼠骨髓无诱发微核的作用（见表 4）。
2.3 硫酸粘杆菌素对小鼠精子畸形的影响
硫酸粘杆菌素各剂量组诱发的精子畸形率与阴性对照组相比，均无显著性差异（P＞0.05），各剂量组之间亦无显著性差异（P＞0.05），未表现出剂量效应关系，而各剂量组及阴性对照组与阳性对照组比较，差异极显著（P<0.01），表明该药对小鼠精子无致突变作用。详细结果见表 5。
3 讨论
1）硫酸粘杆菌素对小鼠骨髓细胞微核形成及对小鼠精子畸形的影响，硫酸粘杆菌素高、中、低三个剂量组的小鼠骨髓细胞微核率与阴性对照组比较，差异不显著（P＞0.05），试验结果为阴性，表明硫酸粘杆菌素对小鼠骨髓无诱发微核作用；精子畸形试验结果也为阴性，表明其对小鼠精子的形成无致突变的作用，且该药的小鼠经口 LD50为 711.54 mg/kg，属低毒类药物，故此结果为该药在临床中的使用安全性提供了参考数据。
2）微核试验是通过检测哺乳动物骨髓细胞中嗜多染红细胞的微核出现率，间接反映骨髓细胞染色体畸变发生率的高低，是检测染色体损伤的一种快速、经济、简便的致突变筛选实验。已知的一些染色体畸变剂，如 X－ray[3]、环磷酰胺[4, 、丝裂霉素[6]、阿霉素[7]等均可显著升高受试鼠的微核出现率，为此，本试验选择环磷酰胺为阳性对照，且有研究表明，环磷酰胺单次染毒后 36～48 h 后可出现微核骨髓嗜染红细胞（MNPCE）的计数高峰，进一步研究发现 MNPCE 的高峰不会很快升降，在高峰前后 6 h 采样均能高效地检出 MNPCE[8]，为减轻本研究工作量，环磷酰胺阳性对照组采样时间只选取 36 h 和 48 h，比较两点的微核率，差异不显著（P>0.05）。另有研究表明，小鼠骨髓微核的自发率小于 3 ‰[9]，本试验结果为 1.33 ‰，符合该要求。由于硫酸粘杆菌素的毒性资料不多，故本研究中采用硫酸粘杆菌素一次染毒后多点采样的方式，且采样时间点延长至给药后 96 h，以确保硫酸粘杆菌素对小鼠骨髓细胞微核的检出率，使结果更为可靠。
3）小鼠精子畸形试验对于检测外来化合物对雄性生殖细胞的遗传物质损伤具有相当高的敏感性，但是不同发育阶段的生殖细胞对于化合物的敏感性不同。有资料表明，精原细胞后期或初级精母细胞早期对化学诱变剂较为敏感，首次给药 4～5 周后一次性检查获得的精子畸形率较高，连续 5 次给药的亚急性试验比一次性急性试验更具有重现性[10, 11]，故本试验选择连续 5 d 给药，第 35 天采样。另外精子畸形试验的成功与否，其关键是精子悬液的制备和制片，它可直接影响镜检时有无足够的精子计数及试验结果的取得。常规方法中[12]，由于需要剪碎、过滤和离心沉渣的搅散等过程，在制片过程中增加了人为造成精子损害的机会，故本研究中，在常规方法的基础上做了些改进，省略了剪碎、过滤和离心等对精子损伤较大的操作过程，改进法精子断头、断尾比例很小，分散均匀，片中渣子少，便于观察计数，故认为改进后的制片方法值得推广应用。
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