王康俊,王　妤(海南省药品检验所,海南海口　570216)
　　硫酸粘菌素颗粒(商品名:可利迈仙)进品药品,是一种窄谱的抗生素,用于治疗敏感菌感染引起的儿童腹泻。其质量标准中未列微生物限度的检验方法。为此,本文对硫酸粘菌素颗粒的微生物限度的检查方法进行了验证试验。
1　材料与方法
1 .1　试验材料
1 .1 .1　样品　硫酸粘菌素颗粒(062032,泰国ＡｔｌａｎｔｉｃＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＣｏｒｐ.Ｌｔｄ.生产)。
1 .1. 2　验证用菌种[1]　大肠埃希菌ＣＭＣＣ(Ｂ)44102、枯草芽孢杆菌ＣＭＣＣ(Ｂ)63501、金黄色葡萄球菌ＣＭＣＣ(Ｂ)26003、白色念珠菌ＣＭＣＣ(Ｆ)10231、黑曲霉ＣＭＣＣ(Ｆ)98003由中国药品生物检定所提供。
1 .1. 3　培养基　玫瑰红钠琼脂,批号:040929;营养琼脂,批号:050110;营养肉汤,批号:041011;真菌培养基,批号:050103;胆盐乳糖培养基,批号:060117;ＭＵＧ,批号:051207。北京三药科技开发公司生产。
1 .2　试验方法采用薄膜过滤贴膜法[1]。
1 .2 .1　供试品的制备　取本品10ｇ溶于100ｍＬ的ｐＨ7 .0氯化钠 蛋白胨缓冲液中,作为1∶10的供试液。
1 .2 .2　菌液制备[1,2]　分别取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉在相应的温度下培养18～24ｈ的肉汤培养物及真菌营养培养物1ｍＬ+9ｍＬ灭菌生理盐水10倍稀释后,再稀释至10 .5～10 .7,做活菌计数(活菌数约为50～100ｃｆｕ/ｍＬ)备用。
1. 2. 3　试验各组制备　试验组制备[3,4]:分别取1∶10供试液10份,每份10ｍＬ分别薄膜过滤,以ｐＨ7 .0氯化钠 蛋白胨缓冲液为冲洗液冲洗,每次100ｍＬ,共冲洗5次和10次,在最后1次冲洗液中分别加入1ｍＬ上述制备好的5种菌的菌液,过滤取出滤膜,细菌分别贴于1个营养琼脂平皿中于30～35℃培养,真菌分别贴于1个玫瑰红钠琼脂平皿中于24～28℃培养,每天观察结果。活菌组制备[2,3]:测定每一菌株的试验菌数,采用平板菌落计数法。供试品组制备[2,3]:不加菌液,其它操作同试验组,测量样品本底菌数。稀释剂对照组制备[2,3]:取ｐＨ7. 0氯化钠 蛋白胨缓冲液500ｍＬ过滤,在最后1次冲洗液中逐一加入试验菌1ｍＬ,取出滤膜分别接种于相应培养基中培养。
1. 2 .4　控制菌检查方法[1]　
①试验组:共作2个膜,每膜加10ｍＬ(1∶10供试液),薄膜过滤,以ｐＨ7 0氯化钠 蛋白胨缓冲液为冲洗液冲洗,每次100ｍＬ,共冲洗5次,取出滤膜,分别培养于100ｍＬ胆盐乳糖增菌液各2份中,其中1份加入50～100ｃｆｕ/ｍＬ大肠埃希菌株,置规定温度培养24ｈ观察结果。
②阴性对照组:取100ｍＬ胆盐乳糖增菌液,加入50～100ｃｆｕ/ｍＬ金黄色葡萄球菌株,置规定温度培养24ｈ观察结果。取上述培养物各0 .2ｍＬ接种至5ｍＬＭＵＧ培养基试管内培养,于5ｈ、24ｈ在365ｎｍ的紫外灯下观察,同时用未接种的ＭＵＧ培养基做本底对照。
2　试验结果回收率计算公式:①试验组回收率%=(试验组菌落数均值 供试品对照组菌落数均值)/菌液组菌落数均值×100%;②稀释剂对照组菌落数=稀释剂对照组均值/菌液组菌落数均值×100%。人工染菌的回收率结果见表1,大肠埃希菌检查方法结果见表2。

3　讨论
    试验数据来源说明:本样品采用冲冼量为500ｍＬ测定细菌数及冲洗量为1000ｍＬ测定真菌数,结果均为零。表1数据为独立试验3次,并为独立3次加入已知菌测定结果的平均值。从表1结果可以看出,采用薄膜过滤贴膜法测定硫酸多粘菌素颗粒供试品,人工污染5株代表菌株,在冲洗量为500ｍＬ时,白色念珠菌和黑曲霉的回收率试验均高于90%,符合验证的要求;大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌有不同程度的抗菌活性,回收率试验均低于40%,不符合验证要求;在冲洗量加大为1000ｍＬ时,大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的回收率试验均高于90%,符合验证要求。表2的结果表明,本品的控制菌大肠埃希菌检查可用薄膜过滤法,冲洗量为500ｍＬ。
    根据上述结果,本品的微生物限度检查应采用中国药典微生物限度检查方法中的薄膜过滤法进行,薄膜过滤的供试品溶液的量为10ｍＬ(1∶10),细菌数的冲洗量为1000ｍＬ,霉菌和酵母菌数冲洗量为500ｍＬ,控制菌大肠埃希菌的冲洗量为500ｍＬ。存在问题:现行《中国药典》及现行的国家标准所列的微生物限度检查方法均笼统,药品常有抑菌现象,这就必然造成检验结果出现假阴性的情况。因此,建议今后每个品种的微生物限度检查方法详细描述并写入标准中。
参考文献
1　药典委员会.中国药典(二部)[Ｍ].北京:化工出版社,2005 附录79
2　王英.医学微生物实验室菌种的保存和保管[Ｊ].海南医学院学报,2006,12(1):57 58
3　应国红 18种中成药污染细菌的回收率试验[Ｊ].江西中医学院学报,2005,17(3):65
4　杜娟 三高茶的微生物限度检查方法验证研究[Ｊ].中国药事,2006,20(3):156