凤 权，汤 斌
（安徽工程科技学院生化工程系，安徽芜湖 ２４１０００）
硫酸粘杆菌素又名克利斯汀、多粘菌素E等，系由多粘杆菌培养液中获得的碱性琐环状多肽类抗生素，是多粘菌素犈１和犈２的混合物．硫酸粘杆菌素几乎对所有革兰氏阴性菌有效．防治大肠杆菌、绿脓杆菌、沙门氏菌等革兰氏阴性菌引起的肠道疾病．在动物体内没有耐药菌选择性，而且不会通过耐药因子传递耐药性；几乎不被畜禽消化道吸收，组织无残留．是最安全的畜禽促生长抗生素之一［１～３］．目前的硫酸粘杆菌素生物效价检测方法药典主要有“浊度法”和“管碟法”［４］，浊度法是利用抗生素在液体培养基中对实验菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对实验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价的一种方法．管碟法主要是利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的实验菌产生抑菌圈的大小来测定供试品效价．管碟法中传统的做法是标准曲线法，由于制作标准曲线的反应条件与供试品效价测量的相关条件很难得到一致，虽然通过校正所测数据来弥补其存在的不足，但由于过程繁琐，系统误差偏大已很少被采用．管碟法中的“二剂量法”由于标准品和供试品在同一碟中，克服了标准曲线法的部分不足，操作也相对简便，因此其应用最为广泛［５，６］．笔者以“二剂量法”为基础，对其进行了改进，即不加入底层培养基，直接向培养皿中加入菌层培养基，并对相关因素进行分析，取得了较满意的结果．
１ 材料与方法
１．１ 实验材料
（１）指示菌：大肠杆菌（犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻），由皖北制药厂提供．
（２）效价测定培养基：蛋白胨１犵，牛肉膏０．３g，葡萄糖０．２５g，NaCl 2g，K2HPP4 0.25g，H2O 100ml．琼脂1.6g，调PH为7.1，在0.1MPa压力下灭菌20min．
（３）大肠杆菌斜面培养基：培养基VI（配方见《中华人民共和国药典》２００５版，附录犡犐犃抗生素微生物鉴定法）．
（４）指示菌悬液：将大肠杆菌的营养琼脂斜面培养物，接种于斜面培养基上，在３６℃下培养２２犺，用时，用接种环刮取适量菌苔置于灭菌蒸馏水中．
（５）硫酸粘杆菌素标准液：准确称取硫酸粘杆菌素标准品（含量１９５３６u／ml），溶于灭菌磷酸盐缓冲溶液（PH＝６．０）中，配成１０００u／ml的标准贮备液，试验时分别稀释成１００u／ml，和５０狌／犿犔的高低浓度标准液．（
６）硫酸粘杆菌素供试品：硫酸粘杆菌素预混剂（含量１０％）浙江康裕生物制药有限公司生产，试验时分别用灭菌磷酸盐缓冲溶液稀释成１００狌／犿犔和５０狌／犿犔的高低浓度供试品溶液．１．２ 实验器材牛津杯内径（６．０±０．１）mm，外径（７．８±０．１）mm，高（１０．０±０．１）mm，抗生素效价检测培养皿（内径９０mm，高１６～１７mm）．
１．３ 实验方法利用硫酸粘杆菌素在培养基内的扩散渗透作用，将其稀释液加入到已放置在菌层培养基上的牛津杯内，置于恒温箱中３５～３７℃培养１６～１８犺，测量各平板的抑菌圈直径，根据抑菌圈直径的大小进行实验条件的选择．
２ 实验条件的选择
２．１ 培养基中菌体浓度的选择［７］
用１０犿犔的灭菌水将大肠杆菌从琼脂斜面上洗下，制得原液，再逐步稀释．向１００ml的培养基中分别加入１犿犔不同浓度的菌悬液．不同指示菌浓度对检测结果的影响见表１．
从实验结果中可以看出，向１００犿犔的培养基中加入将原液稀释１００倍后100ml的菌悬液，即培养基中菌体含量在１．７×１０(e5)cfc/ml左右时，其产生的抑菌圈非常清晰，最容易观察和测量．
２．２ 培养基加入量的选择",按照上述试验中最佳菌悬液浓度制备５个平板，加入培养基的量分别为４ml、６ml、８ml、１０ml、１２ml．以抑菌圈直径为纵坐标，硫酸粘杆菌素效价的对数为横坐标，绘制曲线．曲线的斜率越大表示效价的增加幅度一定时，抑菌圈直径的差异越大，意味着检测时灵敏度较高［８］．由于４犿犔培养基量太少，无法完全覆盖培养皿底部，其他组的试验结果如图１（略）所示．
从图表中可以看出，加入６犿犔的培养基曲线的斜率最大，检测时灵敏度最高．由抗生素在琼脂内扩散的动力学公式
可知，抑菌圈直径与抗生素总量M、抗生素扩散时间犜呈正相关，而与培养基的厚度T呈负相关．本试验结果与动力学公式相符．
２．３ 试验可靠性检验采用试验中得到的培养基量和菌体浓度进行硫酸粘杆菌素预混剂的效价测定，标准品的高低浓度分别为１００单位和５０单位，供试品的估计效价分别为１００单位和５０单位．试验数据如表２．对表２的单层法测定硫酸粘杆菌素预混剂所得的抑菌圈直径进行统计学分析，结果如表３．从方差分析结果可以看出，直线回归差异非常显著（P＜０．０１），偏离平行项差异不显著（＞０．０５），实验结果可靠．
２．４ 效价和可信限率计算测量效价：
Aτ=Pτ*R
式中：Pτ为供试品估计效价；R为标准品与供试品等反应剂量的比值．
３ 结 论
通过对硫酸粘杆菌素的生物效价测量的“二剂量法”进行部分改进，将原先的双层改为单层，使操作更为简便，并对测量过程中的主要影响因素进行试验摸索，得出在培养基中菌体含量在１．７×１０５犮犳狌／犿犔左右培养基加入量为６犿犔为最佳测定条件，并在此条件基础上进行的效价测量实验进行可靠性分析和可信限率计算，直线回归差异非常显著（犘＜０．０１），偏离平行项差异不显著（＞０．０５），可信限率犉犔＝１．３３＜５％，符合药典中关于生物效价测量的各项要求，数据可靠，结果成立．
|
