王丽平,江善祥,史晓丽(南京农业大学动物医学院,江苏南京 210095)
硫酸粘杆菌素是从多粘杆菌(Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｏｌｙｍｙｘａ)的培养液中提取的一种碱性多肽类抗生素。对革兰氏阴性杆菌,如大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌等有强大的抗菌作用,对绿脓杆菌作用尤其突出。由于细菌对它不易产生耐药性,兽医临床上常用于口服给药治疗动物肠道细菌感染。该药我国批准进口(日本)多年,市场反应良好,现国内已有部分兽药厂家生产出该药,并已进行了药效学方面的研究,但有关毒理学研究并不多。为了解山东鲁抗生产的硫酸多粘菌素的使用安全性,特对该药进行了急性毒性及微核试验,为从毒理学方面对该药进行评价提供理论依据。
1 材料与方法
1 .1 试验动物及药品试剂
昆明种小白鼠,雌雄各半,体重18～22ｇ,由江苏省中医药大学实验动物中心提供。硫酸粘杆菌素:山东鲁抗提供,效价22000Ｕ/ｍｇ。环磷酰胺:上海华联制药有限公司生产,批号:010706。姬姆萨染色液、甲醇(分析纯)、甘油(分析纯)、小牛血清、生理盐水、ＰＢＳ缓冲液,均由本组提供。
1 .2 硫酸粘杆菌素ＬＤ50的测定
昆明种小白鼠50只,随机分为5组,内服染毒,最大剂量为1200ｍｇ/ｋｇ,最小剂量为578ｍｇ/ｋｇ。观察记录2周内动物出现的毒性反应及死亡数,按改良寇氏法[1]计算ＬＤ50及95%的可信限。
1 .3 微核试验[1]
1. 3 .1 分组与给药
小鼠100只,随机分为5组,染毒前禁食4～8ｈ。染毒方式及剂量如表1所示。
1. 3 .2 骨髓液的制备和涂片
试验组分别于给药后24,36,48,72及96ｈ采样;阳性对照组于给药后24,36ｈ时采样;阴性对照组于24ｈ后采样。各取4只小鼠,颈椎脱臼处死,取两侧股骨,用带针头的2ｍＬ注射器吸取小牛血清,插入骨髓腔内,将骨髓冲入离心管。然后用吸管吹打骨髓团块,使其均匀,以1000ｒ/ｍｉｎ离心10ｍｉｎ。弃去多余上清液,留下约0 .5ｍＬ与沉淀物混匀后,用滴管吸取并滴一滴在清洁载玻片上,推片,每只鼠制片3张。
1. 3 .3 固定和染色
将推好晾干的骨髓片放入染色缸中,用甲醇液固定15ｍｉｎ,取出晾干,用新鲜配制的姬姆萨应用液染色10ｍｉｎ,然后冲洗掉玻片上的染色液,置晾片架上晾干。
1 .3 .4 观察计数
先在低倍镜下进行观察,选择分布均匀、染色较好的区域,再在油镜下观察计数。双盲法计数分析,每张片计数1000个嗜多染红细胞(ＰＣＥ),各时间点所采样品均观察6张片。计数其中的微核数,求出微核千分率,按小鼠骨髓ＰＣＥ微核统计法进行统计分析。统计结果差异显著(Ｐ<0 05)并有剂量反应关系时判为阳性;反之则为阴性。同时还应计数200个细胞中ＰＣＥ与正染红细胞(ＮＣＥ)之比,以观察细胞毒性作用概况。
2 结果
2 .1 硫酸粘杆菌素的急性毒性
大约在染毒2ｈ后最大剂量组的小鼠开始出现不安、跳跃、呼吸急促,随后在几分钟内便死亡。其他剂量组小鼠仅见精神不振、反应迟钝、闭眼伏卧、不食等症状,2～3ｄ后有个别死亡,剖解未见严重病理变化。经试验测定,待测硫酸粘杆菌素对小鼠的口服ＬＤ50为711 54ｍｇ/ｋｇ,其95%可信限为805 01～628 93ｍｇ/ｋｇ。
2. 2 小鼠骨髓细胞ＰＣＥ与ＮＣＥ比值
表2表明,阴性对照组、阳性对照组及硫酸粘杆菌素各剂量组ＰＣＥ与ＮＣＥ比值均在正常范围内(0 6～1 2)[2]。说明ＰＣＥ形成未受抑制,受试物在该剂量下,无细胞毒作用,可排除该因素对微核计数所造成的影响,故结果是可靠的。
2. 3 小鼠骨髓微核检出率
表3表明,各用药组与阴性对照组在各时间点相比较,均无显著性差异(Ｐ>0 05),各时间点用药组与阳性对照组比较,差异极显著(Ｐ<0 01);各用药组之间无显著差异(Ｐ>0 05),这说明试验药品的微核率与剂量之间不存在明显的量效反应关系,结果可判为阴性。
3 讨论
本文研究了硫酸粘杆菌素对小鼠的急性毒性及对小鼠骨髓细胞微核率的影响,试验结果表明该药的ＬＤ50为711 54ｍｇ/ｋｇ。按急性毒性分级标准可判断属低毒类药物,且其对小鼠骨髓无诱发微核作用,初步认为该药无潜在的致突变作用。该结果为评价硫酸粘杆菌素的安全性提供了基础数据。微核试验是通过检测哺乳动物骨髓细胞中嗜多染红细胞的微核出现率,间接反映骨髓细胞染色体畸变发生率的高低,是检测染色体损伤的一种快速、经济、简便的致突变筛选试验。已知的一些染色体畸变剂,如Ｘ ｒａｙ[3]、环磷酰胺[4,5]、丝裂霉素[6]、阿霉素[7]等均可显著升高受试鼠的微核出现率,为此,本试验选择环磷酰胺为阳性对照。且有研究表明,环磷酰胺单次染毒后36～48ｈ可出现微核骨髓嗜染红细胞(ＭＮＰＣＥ)的计数高峰。进一步研究发现ＭＮＰＣＥ的高峰不会很快升降,在高峰前后6ｈ采样均能高效地检出ＭＮＰＣＥ[8]。为减轻本研究工作量,环磷酰胺阳性对照组采样时间只选取36ｈ和48ｈ,比较2点的微核率,差异不显著(Ｐ>0 .05)。另外有研究表明,小鼠骨髓微核的自发率小于千分之3[9],本试验结果为千分之1 33,符合该要求。由于硫酸粘杆菌素的毒性资料报道较少,故本研究中采用一次染毒后多点采样的方式,且采样时间点延长至给药后96ｈ,以确保硫酸粘杆菌素致小鼠骨髓细胞微核的检出率,使结果更为可靠。
参考文献:
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