江善祥,陈绍峰　(南京农业大学动物医学院,江苏南京210095)
　　硫酸粘杆菌素(Colistinsulfate)为多肽类抗生素,最近被批准为国家二类新兽药,现已上市。该药抗菌谱较窄,仅对革兰氏阴性杆菌有强大的抗菌作用,对绿脓杆菌效果尤为显著,主要作用于敏感细菌的细胞膜而起杀菌作用。硫酸粘杆菌素口服吸收少,注射毒性大,对革兰氏阴性菌有强大的抗菌作用,不易产生耐药性,因此在兽医临床上最主要的用途就是治疗肠道感染和作为饲用抗生素添加剂,用以防病和促生长[1]。　　长期以来,对于抗菌药物,人们只是根据体外最小抑菌浓度(MIC)和药动学参数确定给药间隔时间和给药剂量。体外MIC的测定受诸多因素的影响,差异很大。自从20世纪70年代明确提出抗生素后效应(post-antibioticeffect,PAE)这一概念之后,人们开始对其进行了较为深入的研究。抗生素后效应是指当抗生素与细菌接触一短暂时间后,即使药物的浓度逐渐降低,低于MIC或将药物完全去除后,仍然对幸存细菌的生长有持续抑制作用[2,3]。几乎所有的抗菌药物均有PAE表现,不同药物对不同细菌其PAE不同[4]。由于硫酸粘杆菌素属于新药,其PAE现象在医学和兽医临床均未见相关报道。本试验测定了硫酸粘杆菌素对大肠杆菌不同菌株的PAE,探讨了药物作用时间及浓度对PAE的影响,旨在为硫酸粘杆菌素的应用提供理论依据。
1　材料与方法
1.1　药品与试剂
　硫酸粘杆菌素标准品,效价20100IU/mg,批号020228,中国兽药监察所提供。磷酸氢二钾、氢氧化钠、磷酸二氢钾、氯化钠,均为分析纯试剂;蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、琼脂、酪蛋白酸性水解物等,均为生化试剂。1.2　菌种与培养　大肠杆菌ATCC25922(中国兽药监察所提供,南京农业大学动物医学院预防医学系保存)、大肠杆菌猪临床分离株 和 (南京农业大学动物医学院预防医学系保存)、大肠杆菌CMCC44103(中国兽药监察所提供)。细菌培养用普通琼脂培养基和MH培养液。
1.3　抗菌活性测定
　用微量稀释法[5]测定硫酸粘杆菌素对4株大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。
1.4　体外PAE测定
1.4.1　硫酸粘杆菌素对不同菌株的PAE测定　取4只试管,各加入0.9mL对数生长期细菌悬液,第1、3管再加入0.1mL无菌生理盐水,第2、4管加入0.1mL不同浓度药液,使得药物终浓度为原液的1/10。第1、2管置于温箱37℃培养孵育一定时间,用10-3稀释法去除药物,即从各管中取出0.1mL菌液用新鲜预温MHB液稀释至10-3于温箱中培养,此为重建后0时刻,于重建后0时刻及不同时间点取各管菌液0.1mL进行细菌计数。第3管加入药液使得药物浓度与第2管稀释后终浓度相当,此管为残留药物持续对照组,第4管直接计数,此管为药物的杀菌对照组。根据稀释度计算cfu/mL,以logcfu/mL为纵轴,以时间(T)为横轴作图,建立细菌生长动力学曲线,重复3次,按公式计算PAE值(h)。PAE=T-C,其中T为加药组cfu/mL增加1个对数级(1log)所需时间,C为对照组cfu/mL增加1个对数级(1log)所需时间。
1.4.2　药物作用时间对硫酸粘杆菌素PAE的影响　具体操作方法同1.4.1,测定硫酸粘杆菌素2MIC浓度下对大肠杆菌CMCC44103作用2、4、6h后的PAE。
1.4.3　药物浓度对硫酸粘杆菌素PAE的影响　具体操作方法同1.4.1,测定硫酸粘杆菌素64、32、16、8、4、2MIC浓度下对大肠杆菌CMCC44103作用2h后的PAE。
1.5　数据处理
　数据均以“平均数±标准差”表示,统计学处理用Statistic软件进行t检验,回归分析和方差分析用Ex-cel2000处理。
2　结果
2.1　硫酸粘杆菌素的抗菌活性　见表1。硫酸粘杆菌素对大肠杆菌CMCC44103的MIC最小,抗菌活性最强;对大肠杆菌ATCC25922次之;对2株临床分离株作用相似。除2株分离株间差异不显著外(P>0.05),其余各菌间差异均极显著(P<0.01);硫酸粘杆菌素对2株标准大肠杆菌的MBC小于2株临床分离株的MBC,差异极显著(P<0.01)。

2.2.3　药物浓度对硫酸粘杆菌素PAE的影响
　见图3。64、32、16、8、4、2MIC硫酸粘杆菌素对大肠杆菌CMCC44103作用2h后,其PAE平均值分别为0.517、2.487、2.037、1.727、1.467、1.057h。2～4MIC时,硫酸粘杆菌素对大肠杆菌CM-CC44103的PAE增加较快,斜率较大;4～32MIC时,PAE增加较缓慢;在32MIC时,PAE达峰值;64MIC时,PAE急剧下降。
3　讨论
3.1　硫酸粘杆菌素的体外抗菌活性　在兽医临床上,硫酸粘杆菌素多用于敏感革兰氏阴性菌引起的细菌性疾病。本试验选取了2株标准大肠杆菌(E.coliCMCC44103、ATCC25922)、2株临床分离株(大肠杆菌猪分离株 、 ),3次试验测得硫酸粘杆菌素对4株大肠杆菌的MIC和MBC值均一致,MIC在0.2～0.8mg/L之间,MBC在0.8～1.6mg/L之间,其中对大肠杆菌CMCC44103的MIC值为0.2mg/L,这与吴佩玲[6]的筛选结果一致。方差分析结果表明,除2株临床分离株间MIC差异不显著外(P>0.05),其余菌株间差异均显著(P<0.05)。该结果与组内(每个菌株每次测得的MIC值)无差异有关。由此说明,硫酸粘杆菌素对大肠杆菌不同菌株间及标准株之间的抗菌活性存在一定差异。虽然标准株与临床分离株抗菌活性存在差异,但也不表明临床分离株产生了耐药性。本试验标准株与临床分离株MIC仅相差0.4～0.6mg/L,且其MIC值小于8mg/L,按NCCLS(Nationalcommitteeofclinicallaboratorystandard)判定标准,尚未产生耐药性。这说明硫酸粘杆菌素在临床上产生耐药性较缓慢。3.2　硫酸粘杆菌素的体外PAE　体外PAE的测定参照了陈秀枢[7]的方法,并作适当修改。试验中发现,现制对数生长期细菌难以控制起始菌液浓度,挑取一两个单个菌落于MH培养液中,37℃培养12～14h可作为对数生长期细菌(菌液浓度可达约108cfu/mL,计数后将该细菌置4℃冰箱中备用,菌液浓度5d内未见较大幅度增加);培养时间再延长,菌液浓度增加约1个对数级,浊度显著增加(主要由于死亡细菌的碎屑或代谢产物的增多而引起)。　　PAE的研究多在体外进行,易受很多因素影响,其中抗生素的消除是测定PAE的关键之一。PAE的测定主要有反复冲洗法、稀释法和酶灭活法。陈秀枢[7]比较了冲洗法与稀释法(n=8),其PAE差异不显著,且冲洗法需用特殊仪器且费时不易掌握。本试验采用10-3稀释去除药物。药物清除后,检测细菌恢复生长的方法有菌落计数法、阻抗法、生物荧光法和分光光度法等。本试验采用菌落计数法。本试验中,硫酸粘杆菌素表现出明显的PAE,其对4株大肠杆菌2MIC接触2h的PAE平均值分别为2.017h(猪分离株 )、1.576h(猪分离株 )、1.062h(E.coliCM-CC44103)、1.999h(E.coliATCC25922)。方差分析表明,硫酸粘杆菌素对猪分离株 和E.coliATCC25922的PAE差异不显著(P>0.05),与其余2株差异均显著(P<0.05)。硫酸粘杆菌素对E.coliATCC25922的PAE与猪分离株 和E.coliCMCC44103的差异均不显著。以上结果分析表明,硫酸粘杆菌素对同一细菌不同菌株间的PAE存在差异。若把PAE<0.5h作无意义或零处理,本试验结果表明,不同MIC(大于MIC浓度,亚抑菌浓度水平未做试验)以及2MIC浓度下作用不同时间,硫酸粘杆菌素对大肠杆菌均存在明显体外PAE。
    本试验表明,随着药物作用浓度的增加,PAE也随之增加。试验中观察到,浓度达32MIC时,PAE值达峰值,但浓度达64MIC后,PAE值大幅下降。这一现象颇为值得关注,这可能与高浓度导致的细菌耐药(逆反效应)有关,残存细菌的恢复生长较为迅速,细菌生长增加1个对数期时间缩短,故PAE期缩短。回归分析表明,在2～32MIC范围内,药物作用浓度与PAE间相关系数为0.89,但在4～32MIC范围内,相关系数达0.975,8～32MIC范围内达0.993。在低浓度时,PAE上升较快,斜率较大;4MIC以上时,浓度与PAE相关性很强,斜率降低。从PAE角度来看,硫酸粘杆菌素属慢效杀菌剂。有学者曾注意到氨基糖苷类与β-内酰胺类等杀菌剂在MIC时对大部分敏感菌已能产生致死性损伤,PAE反映的仅是对耐药菌的作用,因而有人建议采用抗生素的亚抑菌浓度来观察PAE。但是一般而言,无论是哪种给药方式,口服或者注射,体内浓度一般都达不到64MIC,否则将会产生极大的毒副作用。硫酸粘杆菌素浓度在4～32MIC时,PAE时间与浓度呈正相关,呈明显的直线相关,从PAE的角度说明硫酸粘杆菌素为浓度依赖性药物。一般认为接触时间越长,PAE也随之延长,但不同抗生素可能有各自的最佳接触时间。本试验表明,随着硫酸粘杆菌素作用时间的延长,PAE值先增加然后减小。方差分析表明,作用4h的PAE和作用2、6h的差异均显著(P<0.05);作用2h和6h,其PAE差异不显著(P>0.05)。虽然作用时间所选取的时间点较少,仅有2、4、6h3个时间点,但这种变化的趋势还是很明显的。这提示硫酸粘杆菌素的最佳接触时间在4h左右,但最佳作用时间具体为多少,有没有其他的作用峰值,仍需进一步的试验证明。试验中发现,不同批次的试验中,相同的处理,其起始浓度并不完全一致。这可能与菌液存放时间及批间MH质量有关。4℃冰箱中存放1周,细菌缓慢生长并达到生长高峰,1周后细菌数量开始下降,因此会出现相同处理时起始菌液浓度有所变化;同一批配制的MH培养液,如果存放时间超过1周,也会出现混浊,这与可溶性淀粉的溶解度下降有关,需再一次高压才会澄清,但反复的高压会影响MH培养液的质量。
参考文献:
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[5]　戴自英.实用抗菌素学[M].北京:人民卫生出版社,1977.265-269.
[6]　吴佩玲.改进硫酸粘杆菌素含量测定方法的介绍[J].中国兽药杂志,1990,3:22-23.
[7]　陈秀枢.体外抗生素后效应的方法学及其临床金黄色葡萄球菌的研究[J].临床检验杂志,1991,9(2):24-25.