肖希龙,林 斌,张纯萍
(中国农业大学动物医学院,北京 100094)
硫酸多粘菌素Ｅ(ｃｏｌｉｓｔｉｎｓｕｌｆａｔｅ)是一种多肽类抗生素,能与革兰氏阴性菌细胞膜上的磷脂结合,对革兰氏阴性菌呈现强大的抗菌活性,抗菌谱主要为大肠杆菌、绿脓杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、嗜血杆菌等病原菌,并且这些细菌对氨基糖苷类、β-内酰胺类、氟喹诺酮类等常用抗菌药物的耐药性相当普遍,而且许多菌是多重耐药;而硫酸多粘菌素Ｅ不易产生耐药性,至今未发现针对多粘菌素耐药质粒传播的耐药性,因此耐药性扩散传播速度缓慢,大多数革兰氏阴性菌对此药仍相当敏感。另外,硫酸多粘菌素Ｅ是一种带阳性电荷的亲水性分子,能和细菌外膜的脂多糖结合,具有结合内毒素功能,使内毒素失活并抑制其产生,因此Ｅｖａｎｓ等认为:多粘菌素是治疗多重耐药性革兰氏阴性菌感染重要而又有效的手段[1]。目前,国内外硫酸多粘菌素Ｅ兽用产品只有预混剂、饮水剂等内服剂型,不能很好地满足养殖业实际生产需要,特别是不能作为全身性治疗用药。因此,研制硫酸多粘菌素Ｅ注射液,可为目前已广泛存在耐药性的革兰氏阴性菌感染,(特别是损失严重又容易产生耐药性的大肠杆菌感染)以及革兰氏阴性菌全身感染并发内毒素血症的严重疾病提供新的治疗方法及手段。
1 材料与方法
1.1 材料
硫酸多粘菌素Ｅ标准品,含有效成分为694μｇ·ｍｇ-1;硫酸多粘菌素Ｅ原料药,含有效成分为643.5μｇ·ｍｇ-1,均由日本明治制果株式会社提供。检测菌株为大肠杆菌ＣＭＣＣ(Ｂ)44103,由中国兽药监察所提供。昆明系小鼠,由中国人民解放军军事医学科学院动物中心提供。新西兰大白兔和断奶小猪,由北京市海淀区温泉兴旺实验动物繁育场提供。
1.2 硫酸多粘菌素Ｅ注射液的配制及含量检测
将硫酸多粘菌素Ｅ原料药、络合剂、抗氧化剂、止痛剂和稳定剂等按一定比例配成2.5%和5.0%(按有效成分计)的硫酸多粘菌素Ｅ水溶液,用微孔滤膜过滤除菌后,得到淡黄色透明液体的硫酸多粘菌素Ｅ注射液。并采用大肠杆菌ＣＭＣＣ(Ｂ)44103检测注射液中硫酸多粘菌素Ｅ的含量。1.3 硫酸多粘菌素Ｅ注射液稳定性采用农业部兽药稳定性试验技术规范的方法对含量分别为2.5%和5.0%的2种硫酸多粘菌素Ｅ注射液进行温湿联合加速试验、光加速试验、经典恒温加速试验、流通蒸汽加热试验和高压蒸汽加热试验。
1.4 硫酸多粘菌素Ｅ注射液安全性
1.4.1 急性毒性试验(ＬＤ50测定)
取昆明系小鼠按300、360、432、518、622ｍｇ·ｋｇ-1ＢＷ剂量灌服硫酸多粘菌素Ｅ注射液,和按25、30、36、43.2、51.84ｍｇ·ｋｇ-1ＢＷ剂量肌肉注射硫酸多粘菌素Ｅ注射液,分别测定经口ＬＤ50和肌注ＬＤ50。
1.4.2 药物对肝、肾功能的影响
取健康断奶小猪5头,体重在10～15ｋｇ,其中2头按10.0ｍｇ·ｋｇ-1ＢＷ剂量肩部肌肉注射2.5%硫酸多粘菌素Ｅ注射液(每天1次,连续5ｄ);3头按15.0ｍｇ·ｋｇ-1ＢＷ剂量肩部肌肉注射2.5%硫酸多粘菌素Ｅ注射液(每天1次,连续5ｄ)。上午注射,下午采样。分别于第0天(即给药前)、第1、2、3、4、5、7、10天,后腿内侧静脉取血样,供血液形态学及生化指标检查;第10天剖杀,观察可疑的病理变化,对肝、肾等可疑组织取样做病理切片。
1.4.3 局部刺激试验
取体重1.5ｋｇ健康家兔6只,后腿两侧的臀部皮肤备毛,24ｈ后在备毛处分别注射灭菌生理盐水、2.5%或5.0%硫酸多粘菌素Ｅ注射液0.5ｍｌ,观察皮肤表面的反应及变化情况,48ｈ后将兔处死,剖开肌肉,观察药液吸收情况及有无病理变化,并取可疑组织做病理切片。另取健康断奶小猪2头分别在左右臀部肌肉注射2.5%或5.0%硫酸多粘菌素Ｅ注射液0.5ｍｌ,48ｈ后将猪处死,剖开肌肉,观察药液吸收情况及有无病理变化,并取可疑组织做病理切片。
1.4.4 硫酸多粘菌素Ｅ注射液的药物代谢动力学
(1)给药:取10头健康断奶仔猪分为2组,每组5头,分别以2.5ｍｇ·ｋｇ-1ＢＷ和5.0ｍｇ·ｋｇ-1ＢＷ的剂量于大腿深部肌注给药;并以2.5ｍｇ·ｋｇ-1ＢＷ的剂量耳静脉注射给药。每头猪两种途径给药的间隔期为7ｄ。
(2)血样采集:给药前采1次血样,作为空白样。给药后的采血样时间分别为15、30、45、60、120、180、240、360、480、720、1440ｍｉｎ。每次均用无菌带塞离心试管从尾静脉采血5ｍｌ。
(3)血样处理:将采集血样置于37℃恒温箱中静置2ｈ,然后以3000ｒ/ｍｉｎ离心10ｍｉｎ,以无菌操作方式分离出血清,置于-20℃冰箱中贮存,待测。(4)血清中药物含量的测定:以含硫酸多粘菌素Ｅ1.6μｇ·ｍｌ-1标准血清样品为对照浓度,将融化后的分离血清按生物检定法检测硫酸多粘菌素Ｅ的含量。如果血清样品中硫酸多粘菌素Ｅ浓度超过6.4μｇ·ｍｌ-1,则将该样品用空白血清稀释1倍后复测。
2 结果与分析
2.1 硫酸多粘菌素Ｅ注射液稳定性研究
2.1.1 温湿联合加速试验
以2.5%和5.0%的硫酸多粘菌素Ｅ注射液进行温湿联合加速试验,结果见表1。在试验过程中,硫酸多粘菌素Ｅ注射液澄明度没有明显变化,均为透明;外观色泽变化不大,试验开始及结束均为淡黄色或浅黄色。
2.1.2 光加速试验
光加速试验后药物的相对含量为96.9%～98.88%,ｐＨ值变化为-0.08～0.36,其它指标无明显变化。结果表明,2.5%和5.0%的硫酸多粘菌素Ｅ注射液基本满足农业部兽药稳定性试验技术规范的要求,故室温贮存期可暂定为2年。
2.1.3 经典恒温加速试验
不同温度下,2.5%和5.0%的2种硫酸多粘菌素Ｅ注射液含量变化情况见表2。以相同时间间隔取样,样品中硫酸多粘菌素Ｅ含量会随温度升高而降低,表明温度升高后,注射液中硫酸多粘菌素Ｅ降解速度加快;相同温度下,随加速时间的延长,含量逐渐下降。
分别以表2中药物含量的对数值与时间作线性回归,计算出2.5%和5.0%2种注射液的活化能分别为88.01和77.71ｋＪ·ｍｏｌ-1;在25℃条件下,硫酸多粘菌素Ｅ注射液药物降解速率常数Ｋ分别为1.3074×10-4和1.3596×10-4;由于反应均符合一级反应,根据公式ｔ0.9=0.1054/Ｋ和ｔ0.5=0.693/Ｋ,求得2种注射液在室温条件下贮存期(ｔ0.9)分别为2.21年和2.12年;半衰期(ｔ0.5)分别为14.522年和13.96年。
2.1.4 流通蒸汽加热试验
2种硫酸多粘菌素Ｅ注射液的ｐＨ值(变化为下降0.03～0.10)和药物含量(相对含量为97.56%～98.66%)变化不大,其澄明度、外观色泽均无明显变化,因此,该方法可用于硫酸多粘菌素Ｅ注射液的灭菌。
2.1.5 高压蒸汽加热试验
2.5%和5.0%硫酸多粘菌素Ｅ注射液在高压蒸汽条件下加热,药物含量(相对含量为96.68%～98.0%)及ｐＨ值(变化为下降0.04～0.12)变化不大,其它指标如注射液澄明度、外观色泽均无明显变化,因此,高压蒸汽加热法也可用于硫酸多粘菌素Ｅ注射液的灭菌。
2.2 硫酸多粘菌素Ｅ注射液安全性研究
2.2.1 急性毒性试验(ＬＤ50测定)
硫酸多粘菌素Ｅ注射液内服或肌内注射时,试验小鼠急性中毒症状基本相似,开始表现为运动失调,兴奋不安,后逐渐呆滞不动,此后腹式呼吸明显,全身无力、瘫痪,直至死亡;硫酸多粘菌素Ｅ半数致死量(ＬＤ50)分别为38.72ｍｇ·ｋｇ-1(肌注)和431.39ｍｇ·ｋｇ-1(内服);95%可信限分别为35.72～41.97ｍｇ·ｋｇ-1和414.32～449.16ｍｇ·ｋｇ-1。
2.2.2 药物对肝、肾功能的影响
在整个试验过程中,注射10.0ｍｇ·ｋｇ-1的2头仔猪饮欲、食欲、精神状况等均无变化;注射15.0ｍｇ·ｋｇ-1的3头仔猪均在第4次或第5次注药后2ｈ表现出精神萎靡,饮欲、食欲均下降(但未废绝),之后缓慢加剧,但在最后一次用药后24～48ｈ均恢复正常。大体剖检表明:除注射15.0ｍｇ·ｋｇ-1剂量的1头猪肾脏髓质出现轻微出血外,其它内脏器官均无明显的肉眼可见病理变化,有个别猪只注射部位肌肉发红,但吸收完全。2种剂量组10.0ｍｇ·ｋｇ-1和15.0ｍｇ·ｋｇ-1的小猪血样生化指标结果表明,所有总蛋白(ＴＰ)、白蛋白(ＡＬＢ)、葡萄糖(ＧＬＵ)指标均在正常范围;与肾功能相关的指标(如:尿素氮、尿酸、肌酐)基本正常,但在第4、5、7天的尿素氮指标稍超出正常值,分别为10.47、10.20和9.67ｍｍｏｌ·Ｌ-1,尿酸指标波动较大(12.8～387.7μｍｏｌ·Ｌ-1),肌酐除10.0ｍｇ·ｋｇ-1剂量组第2天(274.7μｍｏｌ·Ｌ-1)外均在正常范围内;与肝功能相关指标,例如,丙氨酸氨基转移酶(ＡＬＴ)、天门冬氨酸氨基转移酶(ＡＳＴ)、碱性磷酸酶(ＡＬＰ)、γ 谷氨酰转移酶(ＧＧＴ)、乳酸脱氢酶(ＬＤ)均表现为稍超出正常值,其中10.0ｍｇ·ｋｇ-1剂量组ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ、ＧＧＴ、ＬＤ的最大值分别在第4、1、1、2、3天出现,而15.0ｍｇ·ｋｇ-1剂量组最大值分别在第1、2、2、2、7天,基本上是先升高后降低至正常值,所有指标到第10天均基本正常。2个剂量组猪的血液形态学指标,除个别样品的白细胞计数比正常值稍有增加外,其余指标如红细胞计数、血细胞比容、血红蛋白含量、血小板计数、叶状中性粒细胞数、淋巴细胞数、单核细胞数、嗜碱性粒细胞数、嗜酸性粒细胞数均为正常。组织病理切片观察结果表明,低剂量组(10.0ｍｇ·ｋｇ-1)肝细胞出现肿胀,轻度颗粒变性;肾小管上皮细胞肿胀,轻度颗粒变性;肾小球无明显异常变化。高剂量组(15.0ｍｇ·ｋｇ-1)肝细胞、肾小管上皮细胞颗粒变性较为严重,有些胞浆出现崩解,局部可见肾小管上皮呈渐进性坏死状态,间质可见出血现象,并见肾小管内有红细胞、上皮细胞及蛋白管型;肾小球血管内皮细胞肿胀,肾球囊扩张,有的可见囊腔内积均质红染蛋白性物质。
2.2.3 局部刺激试验 6只试验兔注射部位表皮均无明显的变化。在48ｈ剖检注射部位肌肉,观察可见注射生理盐水和2.5%硫酸多粘菌素Ｅ注射液均吸收完全,用药部位肌肉也无明显变化;5.0%硫酸多粘菌素Ｅ注射液用药部位肌肉与周围形成明显反差,注射区发红。断奶仔猪局部刺激试验结果与兔的试验相似。
2.3 硫酸多粘菌素Ｅ注射液药物动力学研究
2.3.1 血清中药物含量的测定
测得硫酸多粘菌素Ｅ注射液在给药后不同时间猪体内的血药浓度结果见表3。
2.3.2 药物动力学
将表3每一剂量每一头猪的血药浓度试验数据分别经3Ｐ97程序处理,结果表明,均为一级吸收二室模型,将同一给药途径同一剂量的药物动力学参数求平均值和标准差(即Ｘ±ＳＤ)(表4)。根据表4中结果可计算出硫酸多粘菌素Ｅ注射液在猪体内的血药浓度时间方程分别为:
3 讨论
3.1 关于硫酸多粘菌素Ｅ注射液的稳定性
根据农业部兽药稳定性试验技术规范(试行)的要求,配制的2.5%和5.0%硫酸多粘菌素Ｅ注射液对光、热的稳定性均良好,药物浓度对数值与时间呈良好线性关系,硫酸多粘菌素Ｅ在注射液中的降解过程为一级动力学反应;2.5%和5.0%的2硫酸多粘菌素Ｅ注射液的活化能(Ｅ)分别为88.01和77.71ｋＪ·ｍｏｌ-1,用Ａｒｒｈｅｎｉｕｓ指数规律[2]来推测室温下(25℃)的贮存期均可达到2年以上。该注射液可用流通蒸汽加热或高压蒸汽加热进行灭菌。
3.2 关于硫酸多粘菌素Ｅ注射液的安全性
本试验结果表明,小鼠肌注或内服硫酸多粘菌素Ｅ急性中毒表现为神经毒性症状和半数致死量与文献报道基本一致[3,4]。多粘菌素Ｅ注射给药时,可能会在注射部位引起疼痛、肿胀[5]。本试验中局部刺激试验结果说明,高浓度(5.0%)硫酸多粘菌素Ｅ注射液对兔及猪的注射部位均有较大刺激,这可能与药物浓度高有关;低浓度(2.5%)硫酸多粘菌素Ｅ注射液对兔及猪的注射部位均无明显的局部刺激。资料表明:肌内注射多粘菌素Ｂ、Ｅ,剂量每天5.0ｍｇ·ｋｇ-1,连续3ｄ,牛肾小球滤过率、有效肾血流速均没有变化[6];火鸡单剂量肌肉注射5000、10000、20000ＩＵ·ｋｇ-1及静脉注射10000ＩＵ·ｋｇ-1均无毒副反应;肌注低于2.5ｍｇ·ｋｇ-1剂量经常用于治疗正常肾功能的小动物尿路严重感染及全身感染[6]。而小鼠皮下注射18.0ｍｇ·ｋｇ-1硫酸多粘菌素Ｅ未发现神经毒性,若按20.0ｍｇ·ｋｇ-1剂量注射多粘菌素Ｂ,每天2次,到第5天所有动物均死亡[10]。从本试验注射硫酸多粘菌素Ｅ对肝脏、肾脏毒性反应来看,按10.0ｍｇ·ｋｇ-1剂量每天1次,连续用药5ｄ,断奶仔猪能够较好耐受,但肝细胞、肾小管上皮细胞均出现轻度颗粒变性,即肝功能相关指标、肾功能相关的个别指标比正常范围偏高,但第10天均恢复正常。当剂量增加为15.0ｍｇ·ｋｇ-1时,在第4～5次用药后会出现轻微神经中毒症状,内脏器官(肝、肾)也有一定的损伤,特别是引发了肾小管肿胀、颗粒变性严重,并可见各种管型。从生化指标检查结果来看,即肝功能相关指标、肾功能相关的个别指标超出了正常范围,与10.0ｍｇ·ｋｇ-1剂量相比,这些数值相对略高,但到第10天几乎全部恢复正常。因此,该试验结果表明,与临床用药时的推荐剂量(2.5ｍｇ·ｋｇ-1)及疗程(每天2次,连续3ｄ)相比,2.5%硫酸多粘菌素Ｅ注射液具备一定的安全性,但如果按15.0ｍｇ·ｋｇ-1剂量(每天1次,连续5ｄ)使用,可能会引发急性中毒。多粘菌素存在的5个游离氨基可与哺乳动物细胞膜上带阴性电荷的磷脂结合,引发动物的毒副作用(包括肾毒性与神经毒性)[4,7]。当重复注射时,多粘菌素在组织中而不是血清中蓄积,肾毒性及神经毒性表现了这些组织对该药物敏感性的上升及结合大量药物后的伤害[7,8],本试验结果与之基本一致,表现出肾毒性与神经毒性。多粘菌素与肝组织结合不会饱和,因而无明显的肝毒性[8]。但本试验结果表明,硫酸多粘菌素Ｅ(按15.0ｍｇ·ｋｇ-1剂量每天1次,连续用药5ｄ)存在一定的肝毒性。
3.3 关于硫酸多粘菌素Ｅ注射液的药物动力学和生物利用度
本研究结果表明,硫酸多粘菌素Ｅ注射液在猪体内的动力学过程均属一级吸收二室模型。由表5可知,硫酸多粘菌素Ｅ在猪体内的吸收分布较快,ｔ1/2ｋａ为10.8±1.3和10.5±1.3ｍｉｎ(5和2.5ｍｇ·ｋｇ-1ＢＷ);消除较慢,ｔ1/2β为264±29和256±14ｍｉｎ(5和2.5ｍｇ·ｋｇ-1ＢＷ)。ｔ1/2β远大于ｔ1/2α,说明清除缓慢,连续用药会引起药物浓度的蓄积,因此,不宜长时间用药。此外,肌注后中心室至周边室和周边室至中心室的转运速度常数ｋ12和ｋ21的数据差别较大,表明该药是以不同速度在血循环系统和组织脏器间分配,可能会导致药物在组织内的滞留,因此,肌注后应有一段时间的休药期,这与Ｚｉｖ等的研究结果一致[9]。另外,从肌注的药物动力学参数发现,Ｃｍａｘ和ＡＵＣ与剂量均呈正比关系,ｔ1/2基本不变,表明在此剂量范围内,硫酸多粘菌素Ｅ在猪体内的药物动力学呈一级动力学特征。猪单剂量静注给药后的血药浓度测定结果表明,静注后分布较快,其消除半衰期ｔ1/2β为251±13ｍｉｎ,与肌注基本相同;其药时曲线下面积(ＡＵＣ)为822±65μｇ·ｍｌ-1。本研究测定的肌注硫酸多粘菌素Ｅ注射液的绝对生物利用度为82.29%～112.15%,表明本制剂生物利用度较高。此外,不同个体、不同剂量的绝对生物利用度稍有差别,这可能与给药剂量和试验对象之间的个体差异有关。药物动力学的研究结果表明,以2.5和5.0ｍｇ·ｋｇ-1ＢＷ的剂量肌注后,到第12小时的血药浓度仍大于0.2μｇ·ｍｌ-1,这远大于抑制大肠杆菌等致病菌生长繁殖的最低浓度,而24ｈ的血药浓度就检测不到了,因此,确定硫酸多粘菌素Ｅ注射液在猪体内的给药方案为:给药剂量2.5ｍｇ·ｋｇ-1ＢＷ,每日2次。
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