张纯萍1,肖希龙2,林 斌2
(1 中国兽药监察所,北京100081;2 中国农业大学动物医学院,北京100094)
多粘菌素Ｅ(ＰｏｌｙｍｙｘｉｎＥ)又名粘杆菌素(Ｃｏｌ ｉｓｔｉｎ),是1950年由日本的小山康夫从多粘芽胞杆菌抗敌素变株(Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｏｌｙｍｙｘａｖａｒ.ｃｏｌｉｓｔｉｎｕｓ)是培养液中提取的一种抗生素[1],一般用其硫酸盐,即硫酸多粘菌素Ｅ。硫酸多粘菌素Ｅ对革兰阴性菌具有强大抗菌作用,并能中和革兰阴性菌产生的内毒素且不易产生耐药性,因此是最有发展前途的抗菌素之一。Ｚｉｖ(1982)[2]等研究了硫酸多粘菌素Ｅ在牛体内的药代动力学和组织分布情况,但对在猪体内的药代动力学则尚未见报道。硫酸多粘菌素Ｅ在猪体内的药代动力学和绝对生物利用度进行了研究,并对国外所用的微生物学方法进行了进一步的改进。
1 材料与方法
1.1 动物 健康长白杂交仔猪5头,3公2母,体重为8～10.5ｋｇ,北京育兴养殖厂提供。试验猪分别进行肌注、静注两种给药方法试验。
1.2 试剂与药品 2.5%硫酸多粘菌素Ｅ注射液(自制);大肠杆菌标准菌株[ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＣＭＣＣ(Ｂ)44103],由中国兽药监察所提供;硫酸多粘菌素Ｅ标准品,由日本明治制果株式会社提供(批号Ｃｏｌ ｗｓ 15 .20,含量694μｇ/ｍｇ)。
1. 3 给药与血样采集
以2. 5ｍｇ/ｋｇｂ.ｗ.和5 .0ｍｇ/ｋｇｂ.ｗ的剂量分别于大腿深部肌注给药;并以2. 5ｍｇ/ｋｇｂ.ｗ.的剂量耳静脉注射给药。每头猪两种途径给药的间隔期为7ｄ。给药前采1次血空白样,给药后的采集血样时间为15、30、45、60、120、180、240、360、480、720、1440ｍｉｎ。每次均用无菌带塞离心试管从尾静脉采血5ｍｌ。然后以3000ｒ/ｍｉｎ离心10ｍｉｎ,无菌操作方式分离出血清,置于冰箱中-20℃贮存,待测。
1 .4 标准血清样品的配制
精密称量干燥标准品,用灭菌磷酸盐缓冲液(ｐＨ6 0)溶解,得到含硫酸多粘菌素Ｅ浓度为100μｇ/ｍｌ的溶液,作为贮备液。取适量猪的无菌空白血清稀释该贮备液,得含硫酸多粘菌素Ｅ浓度分别为0. 1、0. 2、0. 4、0. 8、1. 6、3. 2和6. 4μｇ/ｍｌ的系列溶液,作为标准血清样品。以其中的0. 4、1 .6和6. 4μｇ/ｍｌ标准溶液作为质量控制(ＱＣ)样品,置-20℃冰箱贮存备用。
1. 5 培养基的制备
具体制备方法参见中华人民共和国药典(95版二部和2000版二部)[3,4]。
1. 6 菌悬液的制备
将大肠杆菌在新鲜斜面上连续传代3次后,用接种环轻轻刮取适量菌苔置于灭菌蒸馏水中,使菌苔均匀分散其中,然后在分光光度计600ｎｍ波长下,将菌悬液的吸光度(Ａ)控制为0 1.。菌悬液由试验当天制备。
1. 7 平板(双碟)的制备 加1 .5ｍｌ新制备的菌悬液至100ｍｌ预先融化并冷却至50℃的培养基中,彻底混匀后,加入6ｍｌ于培养皿中,将培养皿两边倾斜并作圆周运动,使培养基均匀分散铺平,并待其凝固。在使用的当天制备平板。
1 .8 标准曲线的制备 将置于-20℃保存的标准血清系列溶液于室温下融化,分析振摇20ｓ(融化后和加样前各10ｓ)。牛津杯中滴加300μｌ的参照浓度标准血清样品,每个浓度至少用3个平板;将菌碟置于冰箱中4℃静置4ｈ,然后于恒温箱中35～37℃培养18ｈ,用游标卡尺(精确度0 .02ｍｍ)测量各浓度的抑菌圈直径,然后以各浓度的自然对数值为纵坐标,以各浓度平均抑菌圈直径的校正值为横坐标绘制标准曲线,并计算此标准曲线的线性回归方程和相关系数。
1. 9 方法的准确度与回收率的测定 取含硫酸多粘菌素Ｅ低、中、高3个浓度(分别为0 4、1 .6、6. 4μｇ/ｍｌ)的ＱＣ样品,每个浓度至少用2个平板,以1 .8的方法测出抑菌圈直径,根据标准曲线计算出ＱＣ样品的测得浓度,与配制浓度对照,连续测定5ｄ,每天测定1次,根据测定结果计算方法的准确度与回收率。
1 .10 血清中药物含量的测定 将融化后的分离血清加入牛津杯中培养后,测出抑菌圈直径,根据标准曲线计算出药物的含量。如果血清样品中药物浓度超过6 4μｇ/ｍｌ,则将该样品用空白血清稀释一倍反复测。1 11 数据处理 采用3Ｐ97实验动力学计算程序[5]处理数据,进行模型拟合并求算药代动力学参数,同时计算出绝对生物利用度。
2 结 果
2 .1 标准曲线的制备
研究按一剂量法的设计原理制备标准曲线。经测定,0. 1μｇ/ｍｌ浓度不能产生清晰的抑菌圈,而0 .2μｇ/ｍｌ为能产生清晰完整抑菌圈的最小浓度,说明本方法的检测限为0 .2μｇ/ｍｌ,这与国外用博德特氏菌ＡＴＣＣ4617作检测菌的检测限基本一致[6,7]。在不同时间制备五组标准曲线,其斜率的变异系数为3. 2%,表明本试验条件下制备的标准曲线变异程度小,具有良好的重复性。在0. 2～6 .4μｇ/ｍｌ的浓度范围内,抑菌圈直径与药物浓度的自然对数值呈良好线性关系,相关系数ｒ=0 9989。标准曲线的回归方程为:
ＬｎＣ=-0 .3085-4 6557ｘ
2. 2 方法的精密度与准确度 按1 9方法计算出ＱＣ样品的测得浓度,与配制浓度对照,以1ｄ内测得的药物浓度计算出日内变异系数,以5ｄ内测得的药物浓度计算日间变异系数,并计算出平均回收率,结果见表1。
由表1知,药物浓度为0 .4、1. 6和6. 4μｇ/ｍｌ的ＱＣ样品,其日内变异系数为2. 6%～3 .8%,平均回收率为94. 0%～100 6%;而日间的变异系数为2 .5%～5 .1%,平均回收率为97 .2%～100 8%。结果表明,测定血清中硫酸多粘菌素Ｅ含量的分析方法重复性好并且符合有关规范的要求,可用于药代动力学和生物利用度试验[8]。
2 .3 血药浓度 时间数据 按1. 10方法操作,结果见表2。
2 .4 药代动力学结果 将以上每一剂量每一头猪的血药浓度实验数据分别经3Ｐ97程序处理,结果表明均为一级吸收二室模型,将同一给药途径同一剂量的药代动力学参数求平均值和标准差(即 ｘ±ＳＤ),结果见表3。
2 .5 绝对生物利用度结果 药物绝对生物利用度(Ｆ)的测定,一般是用非血管途径给药的药时曲线下面积(ＡＵＣ)与该药参比制剂静注ＡＵＣ的比值,以吸收百分率表示,即:
Ｆ=(ＡＵＣｉｍ/ＤＯＳＥｉｍ)/(ＡＵＣｉｖ/ＤＯＳＥｉｖ)根据上面的公式,计算出肌注5. 0ｍｇ/ｋｇｂ.ｗ和2 .5ｍｇ/ｋｇｂ.ｗ剂量的绝对生物利用度结果见表4。
3 讨 论
3 .1 检测方法 目前国外测定硫酸多粘菌素Ｅ的药代动力学所用菌株大多为支气管炎博德特氏菌ＡＴＣＣ4617[2,6,9,11],其在血清或组织中的检测限为0 .05～0. 3μｇ/ｍｌ,但ＡＴＣＣ4617菌种对培养基要求条件高、比较容易死亡且实验操作不便,研究采用中国药典方法,以大肠杆菌ＣＭＣＣ(Ｂ)44103为检测菌,并对药典的方法进行了进一步的改进,使其检测限降至0.2μｇ/ｍｌ,这与用博德特氏菌ＡＴＣＣ4617作检测菌的检测限基本一致,并且本方法的准确度和回收率都符合有关规范[8]要求,因此可用此法进行药代动力学和生物利用度分析。
3 .2 药代动力学和生物利用度 由表3可知,硫酸多粘菌素Ｅ在猪体内的吸收分布较快,ｔ1/2ｋａ为10. 81±1 .35ｍｉｎ和10. 46±1 .25ｍｉｎ(5. 0和2 .5ｍｇ/ｋｇｂ.ｗ.);消除较慢,ｔ1/2β为264 .08±28 .57ｍｉｎ和255. 99±13 65ｍｉｎ(5 .0和2 .5ｍｇ/ｋｇｂ.ｗ.)。ｔ1/2β远大于ｔ1/2α,说明清除缓慢,连续用药会引起药物浓度的蓄积,因此,不宜长时间用药。此外,肌注后中心室至周边室和周边室至中心室的转运速度常数ｋ12和ｋ21的数据差别较大,表明该药是以不同速度在血循环系统和组织脏器间分配,可能会导致药物在组织内的滞留,故肌注后应有一段时间的休药期。从肌注的药代动力学参数发现,Ｃｍａｘ和ＡＵＣ与剂量均呈正比关系,ｔ1/2基本不变,表明在此剂量范围内,硫酸多粘菌素Ｅ在猪体内的药代动力学呈一级动力学特征。猪单剂量静注给药后的血药浓度测定结果表明,静注后分布较快,其消除半衰期ｔ1/2β为251.28±12 .53ｍｉｎ,与肌注基本相同;其药时曲线下面积ＡＵＣ为821 .94±65 .48(μｇ/ｍｌ)·ｍｉｎ。本研究测定的肌注硫酸多粘菌素Ｅ的绝对生物利用度为82 .29%～112. 15%,表明本药物生物利用度较高,但不同个体、不同剂量的绝对生物利用度稍有差别,这可能与给药剂量和实验对象之间的个体差异有关。硫酸多粘菌素Ｅ的抗菌作用,以致病性大肠杆菌为例,其ＭＩＣ值为0. 025～0. 05μｇ/ｍｌ,以0. 05μｇ/ｍｌ计算,药物维持此浓度的时间为18ｈ,因此对于大肠杆菌感染,其给药方案为:给药剂量2. 5ｍｇ/ｋｇｂ.ｗ.,每日肌注两次。但不同细菌对该药的ＭＩＣ值差异较大,所以在临床用药时,应根据不同情况合理设计给药方案。 |
