温芳1,肖希龙2
(1.中国兽医药品监察所,北京100081;2.中国农业大学动物医学院,北京 100094)
粘杆菌素(colistin)是多粘芽孢菌(Bacilluspolymyxa)产生的一组环状多肽,该菌株于1950年被日本的小山康夫在福冈发现。兽医临床所用硫酸粘杆菌素为其硫酸盐,可用于猪、禽、牛和羊等动物,由于其抗菌作用强、残留低,不易产生耐药性,中国、美国、欧盟和日本等许多国家和地区批准其作为饲料添加剂或兽药。硫酸粘杆菌素对革兰氏阴性菌有很强的抑制作用,它可治疗志贺氏痢疾杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、沙门氏杆菌和普通变形杆菌引起的感染;用作饲料添加剂也可促进畜禽生长,提高饲料转化率,预防规模化养殖中畜禽疾病的发生。随着其在养殖业中应用日益增多,动物性食品中硫酸粘杆菌素的残留问题逐步受到各国的重视,欧盟率先制定了粘杆菌素在动物可食用组织中的最高残留限量标准,其中肌肉、肝和肾的最高残留限量标准分别为150、150和200μg/kg。我国农业部公告第235号(发布《动物性食品中兽药最高残留限量》)中规定的粘杆菌素最高残留限量与欧盟的相一致。本研究初步探索一种用微生物方法检测硫酸粘杆菌素的方法,对进一步研究制定适合我国国情、灵敏度高、简便、快捷的残留检测方法具有理论和生产实践上的重要意义。
1 材料
1.1 测试菌株
支气管炎博代特氏菌ATCC4617,批号20011220,中国兽医药品监察所提供。
1.2 试剂和药品
硫酸粘杆菌素标准品,749μg/mg,LotNo.COLWS 17 16,MEIJISEIKAKAISHALTD;营养琼脂,批号010820,北京化学试剂公司;营养肉汤,批号020902,中国兽医药品监察所。
1.3 仪器和器皿
隔水式电热恒温培养箱,上海跃进医疗器械一厂;HOMOGENIZERAm 3组织匀浆机,日本;YXQG01型蒸汽消毒器,山东新华医疗器械厂;LD4 2A离心机,北京医用离心机厂;721型分光光度计山东高密分析仪器厂;小型三用恒温水浴箱,北京市医疗设备厂;旋涡混合器,江苏太仓鹿河生化仪器厂;2XZ 0.25型旋片式真空泵,浙江黄岩医疗器械厂;电子天平(0.01mg),Satorius公司;游标卡尺(精确度0.02mm),北京量用刃具厂;牛津杯(不锈钢,高10mm,外径8.0mm,内径6.0mm),浙江宁海城关白石医药仪器厂;陶瓦盖,购自中国药品生物制品检定所。
2 方法
本研究中所用玻璃器皿均在160℃高温下干热灭菌2h;塑料器皿、培养基和溶液均在121℃高压灭菌15min。
2.1 溶液的配制
2.1.1 磷酸盐缓冲液(PBS,pH6.0)
无水磷酸二氢钾165g和三水磷酸氢二钾90g溶于蒸馏水980mL,用1mol/LNaOH调节pH值为6.0,用蒸馏水定容至1L。
2.1.2 硫酸粘杆菌素标准品贮备液
将硫酸粘杆菌素在小于0.67kPa的真空度下干燥3h,精确称量干燥标准品溶于灭菌磷酸盐缓冲液(pH6.0),配制成终浓度为1000μg/mL的贮备液,于0～4℃存放不超过1个月。
2.2 培养基的制备
2.2.1 斜面培养基(累代保存用培养基,1#培养基)
准确称取营养琼脂45g溶于950mL蒸馏水中,用1mol/LNaOH溶液调节培养基pH为(6.5±0.1),定容至980mL,121℃高压灭菌15min,冷却至56℃加入除菌小牛血清20mL混匀,无菌条件下分装于试管中,高度约为试管的1/5,趁热成一定角度置于木棒上,使凝固后的培养基斜面约为试管高度的1/2。
2.2.2 稀释菌液培养基(2#培养基)
准确称取营养肉汤49g,溶于950mL蒸馏水中,用1mol/LNaOH溶液调节培养基pH为(7.0±0.1),定容至1000mL,121℃高压灭菌15min。
2.2.3 分析培养基(基础、接种层培养基,3#培养基)
氯化钠5g、葡萄糖2.5g、酪蛋白胨17g、大豆蛋白胨3g、磷酸二氢钾2.5g、琼脂15g溶于950mL蒸馏水中,用1mol/LNaOH溶液调节培养基pH为(7.5±0.1),定容至1000mL,121℃高压灭菌15min。
2.2.4 无菌检查和保存
将灭菌后的培养基在37℃恒温培养24h,检查有无菌落生成,将无菌落生成的培养基放入0～4℃冰箱保存,在不超过1个月内使用。
2.3 菌种的培养和保存方法
2.3.1 菌悬液的制备 支气管炎博代特氏菌ATCC4617在斜面培养基连续传代3次后,用生理盐水将菌苔洗下,在721分光光度计580nm波长下使菌液的光透过率控制为0.80,作为菌液储备液,可贮备5d。
2.3.2 菌种的保存
将支气管炎博代特氏菌ATCC4617接种于斜面培养基,置0～4℃冰箱保存,每隔4周传代1次。
2.4 平板的制备
2.4.1 底层
加15mL融化的3#培养基倒于培养皿中,均匀铺平,在水平面上待其凝固。
2.4.2 菌层
将3#培养基融化分装于52℃恒温水浴锅中的试管中,试管分装量为5mL,每管中加入2#培养基稀释菌液1mL,混匀后将管中接种培养基注入1个平皿中,将培养皿两边倾斜并作圆周旋转运动使培养基均匀分散铺平,待其凝固,此平板需在制备后的1h内使用。
2.5 标准曲线的制备
2.5.1 空白鸡肌肉组织提取液的制备
称取20g空白捣碎鸡肌肉组织置于100mL带盖塑料离心管中,加40mLPBS(pH6.0),置于振荡器中中速振荡30min,100℃水浴加热3min,取出冷却,3500r/min离心15min,分离的上清液用1mol/LNaOH调节pH至6.0后,用0.22μm针头式滤器除菌备用。
2.5.2 空白鸡肝脏和肾脏组织提取液的制备
分别称取20g空白捣碎鸡肝脏和肾脏组织置于100mL带盖塑料离心管中,分别加16.2mL5%硫酸,置振荡器中中速振荡30min,加入饱和氢氧化钠2.8mL中和,3500r/min离心15min,分离的上清液用1mol/LNaOH调pH至6.0后,用0.22μm针头式滤器除菌备用。
2.5.3 空白鸡组织提取液活性测定
取各空白鸡组织提取液,37℃平板培养20h,不出现抑菌圈表明空白组织提取液无活性,将提取液在0～4℃保存,作为制备标准曲线稀释液备用,存放不超过7d。
2.5.4 鸡肌肉、肝脏和肾脏组织标准曲线制备
准确量取5mL硫酸粘杆菌素标准品贮备液(1000μg/mL)于50mL容量瓶中,用空白肌肉组织提取液定容,使溶液终浓度为100μg/mL,量取该溶液3.2mL于50mL容量瓶,再用空白肌肉组织提取液定容,得到终浓度为6.4μg/mL溶液,然后用空白肌肉组织提取液倍比稀释,得到终浓度分别为3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025和0.0125μg/mL的工作溶液,其中0.4μg/mL为参照浓度,按一剂量法设计原理制备标准曲线,以各药物浓度对数值为纵坐标,各药物浓度平均抑菌圈直径矫正值为横坐标绘制标准曲线。肝脏和肾脏组织的标准曲线制备方法同肌肉组织。
2.6 回收率测定
2.6.1 样品准备
称取5g捣碎的空白肌肉组织4份分别置于20mL塑料离心管中,分别加入0.5mL药物浓度为36、6、1.5和1μg/mL的工作溶液,使得肌肉组织中硫酸粘杆菌素含量分别为3.6、0.6、0.15和0.1μg/g。分别称取5g捣碎的肝脏和肾脏组织各4份于20mL塑料离心管中,各分别加入0.5mL药物浓度为40、10、2和1.5μg/mL的工作溶液,使得肝脏和肾脏组织中硫酸粘杆菌素含量分别为4.0、1.0、0.2和0.15μg/g,旋涡混合1min,使之充分混匀,0～4℃静置30min,使硫酸粘杆菌素充分渗透到组织中。
2.6.2 提取
肌肉组织提取:在样品中加入9.5mLPBS(pH6.0),置振荡器中中速振荡30min;样品于100℃水浴中加热3min,取出冷却,3500r/min离心15min,分离的上清液用1mol/LNaOH调pH至6.0后,用0.22μm针头式滤器除菌备用。肝脏和肾脏组织提取:在样品中加入8.1mL5%硫酸,置振荡器中中速振荡30min;加入饱和氢氧化钠1.4mL中和,3500r/min离心15min,分离的上清液用1mol/LNaOH调pH至6.0后,用0.22μm针头式滤器除菌备用。
2.7 体内残留的测定
2.7.1 动物分组
1日龄健康肉鸡51只,饲喂4周后,随机分为3组。第1组3只为空白组,第2组18只为低剂量给药组,第3组30只为高剂量给药组。高、低剂量组给药量分别为300mg/L和60mg/L,连续饮水给药7d,。2.7.2 屠宰与取样 空白对照组于停药0h屠宰,低剂量组分别于停药后0、4、8、12、24及72h屠宰,高剂量组分别于停药后0h、4h、8h、12h、24h、2d、3d、4d、5d和7d屠宰,每次屠宰3只,分别取肌肉(胸肌),肝脏(全肝)和肾脏,于-20℃冷冻保存。样本于临分析前解冻,测定方法同2.6.2。
3 结果与讨论
3.1 标准曲线的制备
结果见表1。从表1可以看出,0.0125μg/mL药物浓度不产生抑菌圈,0.025μg/mL为产生清晰、明显抑菌圈的最小药物浓度,说明肌肉、肝脏和肾脏组织中该方法的灵敏度均为0.025μg/mL。肌肉、肝脏和肾脏组织的标准曲线的平均斜率分别是(0.1662±0.0073)、(0.1816±0.0038)、(0.1556±0.0062),变异系数分别为4.4%、2.1%和4.0%。微生物方法中影响测定结果准确性的因素较多,其中平板间的差异是影响方法准确度和重复性的关键问题。影响平板间差异的主要因素有平板是否铺平、牛津杯的加样量是否一致、接种物与培养基是否混合均匀等[1,2]。为了补偿平板之间的差异,一剂量法中用参照浓度的平均抑菌圈直径去校正其他各浓度点的平均抑菌圈直径。
文献[3～6]报道,应用单层培养基可降低微生物法的检测限,但单层培养基测定不易控制平板间的差异,本实验选择应用双层培养基。由于支气管炎博代特氏菌ATCC4617对硫酸粘杆菌素高度敏感,因而在国外普遍用于硫酸粘杆菌素含量和残留的测定,但该菌对培养条件要求较高,本实验参照美国药典方法[7]及Kazuo等[8]报道的培养基配方自制培养基,满足了支气管炎博代特氏菌ATCC4617的生长需要。在我国未见有用支气管炎博代特氏菌ATCC4617检测硫酸粘杆菌素残留的研究,本方法的建立填补了国内研究的一项空白。
3.2 回收率实验
肌肉、肝脏和肾脏组织回收率实验结果见表2。可以看出,肌肉组织0.1μg/g添加水平未检测出药物,0.15μg/g添加水平平均回收率大于60%,说明本方法肌肉组织最低检测限为0.15μg/g,在0.15、0.60及3.6μg/g添加水平下平均回收率分别为62.0%、79.0%和90.9%,变异系数为13.7%、11.4%和5.6%。肝脏和肾脏组织中0.15μg/g添加水平未检测出药物,0.2μg/g添加水平平均回收率大于60%,说明本方法在肝脏和肾脏组织中的最低检测限为0.2μg/g;肝脏中在0.2、1及4μg/g添加水平下平均回收率分别为64.5%、80.2%和93.4%,变异系数为13.8%、5.1%和6.3%。肾脏在0.2、1及4μg/g添加水平下平均回收率分别为65.0%、81.8%和95.9%,变异系数为14.1%、7.2%和6.0%。肌肉、肝脏和肾脏组织回收率均大于60%,变异系数小于15%,符合我国农业部关于残留检测方法对于回收率和变异系数控制的规定。
3.3 体内残留
肌肉高剂量组和低剂量组在停药后各阶段均未测得有硫酸粘杆菌素残留,肝脏和肾脏低剂量组在停药后各阶段均未测得硫酸粘杆菌素的残留,高剂量组在停药0h可测得有微量残留,分别为0.18μg/g和0.19μg/g。硫酸粘杆菌素由于其组成成分的多样性,美国、欧盟和日本等国家和地区均规定微生物检测方法为其官方承认的检测方法[9]。硫酸粘杆菌素在机体内存在的形式有两种:一种是游离状态,一种是结合状态。游离状态药物通过组织匀浆可提取。Kunin和Bugg报道[10],结合态药物可用两倍体积的氯仿∶甲醇(2∶1)提取,65℃旋转蒸干,0.1NH2SO4室温溶解30min,用0.1mol/LNaOH中和调节pH;Kazuo等[8]报道结合态药物可用5%HCl和甲醇经过3次提取并于45℃旋转蒸干。本实验在参考大量文献的基础上,用5%H2SO4提取肝脏和肾脏组织中游离态和结合态的硫酸粘杆菌素,提取液用饱和NaOH中和,肌肉组织用PBS(pH=6.0)提取,100℃水浴加热3min去除蛋白。与本实验的提取方法相比,虽然报道方法的检测限较低为0.05μg/g,但提取方法繁琐,旋转蒸干耗时很长,方法不易重复,且没有报道提取液的净化和除菌方法,测定时牛津杯中残液多,不易扩散,影响测定结果的准确性。本研究中三种组织提取方法简单、快速,去蛋白彻底,可用针头式滤器除菌,方便于实践中大规模样品的检测分析,且鸡肌肉、肝脏和肾脏组织中硫酸粘杆菌素最低检测限均低于欧盟和我国农业部规定的最高残留限量,所以这一检测方法具有较高的实践应用价值。本实验还研究比较了5%H2SO4和pH6.0的PBS对肌肉、肝脏及肾脏组织提取,可能是由于肌肉遇酸易结块,影响肌肉组织中药物的提取效率,所以用5%H2SO4提取肌肉组织其最低检测限较高;肝脏和肾脏组织用pH6.0的PBS提取时,可能由于硫酸粘杆菌素与肝脏、肾脏组织细胞结合牢固,药物提取率较低。现在普遍认可的方法是将微生物检测法与高效液相色谱法结合起来进行硫酸粘杆菌素残留检测的初筛和确证。英国药典[11]规定可依据硫酸粘杆菌素E1和E2的出峰时间确证硫酸粘杆菌素。确证方法的研究还有待于进一步加强。
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