吴俊伟’，杨俊卿2’
1.西南大学动物科技学院药学教研室，重庆荣昌402460;
2.重庆医科大学药学院药理教研室，重庆400016
恩诺沙星(Enrofloxacin)属第3代氟喳诺酮类药物，在兽医临床上对大多数革兰氏阳性菌和阴性菌都具有良好的抗菌活性，并得到了广泛的使用，但随着该药的大剂量使用和滥用，导致许多病原菌对该药产生了明显的耐药性，使得抗菌活性显著下降，并使临床效果越来越不明显。多粘菌素(PolymyxinE)又名抗敌素、粘杆菌素(colistin)，它是1950年由日本的小山康夫从福岛县土壤中分离到的1株多粘芽胞杆菌抗敌素变株(Ba-cillu。polymyxa var.colistinus)的培养液中提取的一种锁环状多肤类抗生素，对革兰阴性菌作用强。国内已有预混剂等产品，注射剂型也已有报道。
多篇文献报道，硫酸粘菌素与多种药物联合应用具有协同作用，这其中包括有与利福平、诺氟沙星、环丙沙星、磺胺嚓陡钠、对氮基苯甲酸、头抱他定的联合抗菌作用，均表现出较好的协同作用，为此本文通过下面的试验考察了硫酸粘菌素与恩诺沙星联合抗菌活性的相互影响。
1材料与方法
1 .1试验材料
1.1.1供试药品
2.5%恩诺沙星注射液;l%硫酸粘菌素注射液。
以上药品由实验室自制，并经含量测定。
1.1.2受试菌株
大肠杆菌「Escherichia coli(Mi邵la)Castellaniand Chalmers〕，血清型:05:K 87，K 88 AC;猪霍乱沙门氏菌[Salmonella choleraesuis(Smith)Weldin]血清型:6，7:c:l，5;多杀性巴氏杆菌[pasteurella multoci-da(Lehmann and Neumann)Rosenbusch and Mer-chant〕，血清型:A:1;金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus Rosenbach)，血清型:CMCC。以上菌株购买于中国兽医药品监察所，并镜检合格。
1.1.3试剂与培养基
肉汤培养基:MH肉汤培养基、鲜血MH肉汤培养基;马丁肉汤培养基。固体培养基:鲜血琼脂培养基，普通琼脂培养基。培养基材料:牛肉膏:批号2004 1 209，北京奥博星生物技术责任有公司;蛋白陈:批号20041211，北京奥博星生物技术责任有限公司;琼脂:批号20046115，重庆东试化工有限公司;Muel-ler一Hinion肉汤:批号040702，中国进出口商品检验技术研究所、北京陆桥技术有限责任公司。上述各种培养基均按照常规方法制备，经过无菌检查合格后，置于4℃冰箱中保存。
1 .1.4仪器及设备
高压蒸汽灭菌锅;LRH一1 505生化培养箱(上海一恒科技有限公司);303B一1型隔水式培养箱(上海一恒科技有限公司);SW一CJ一IFO单人单面净化工作台(苏州净化设备有限公司);TU 1 800一PC可见光紫外分光度计(北京普析通用仪器责任有限公司)。
1.2试验方法
1.2.1菌株传代保存
将各原菌株传代于马丁肉汤培养基中，在37℃恒温培养24h备用。将培养好的菌液用接种环将其钩人鲜血琼脂斜面，在37℃恒温培养24h后，用灭菌
液体石蜡密封，并放入0一4℃冰箱中保存。
1.2.2平板活菌计数
为确定菌液浓度，对4种菌株分别作平板活菌计数:将原菌液以10-1倍稀释，分别如下:10-1，10-2，10-3，10一4，10-5，10一6，10一7;将各菌分别取10一6，10-7的浓度以微量加样器取10林L到预先准备好的MH琼脂平板中，将L型玻璃棒在火焰上灼烧灭菌，冷却后，将菌液均匀推散在培养基表面(无菌检查合格);然后将8个平板培养基放人303B一1型隔水式培养箱中，培养24h后观察，计算菌液浓度。
1.2.3单一药物药敏试验
在5 xll微量稀释板上稀释，以排为单位分为I，n，l，W组:I，n为供试药品组，作为试验平行样;每孔分别加人50μL药液，50μL菌液及50μLMH肉汤;In和W为对照组，nI不加药，每孔只加50μL菌液及50μg/L MH肉汤;lV不加菌，每孔只加人50泌药液及50μg/L MH肉汤。受试菌液采用原菌液10一4C何mL，一个微量稀释板测一种药和一种菌;恩诺沙星注射液按1: 10000倍稀释后，再对4种菌株分别以2倍稀释法稀释;硫酸粘菌素针对大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌分别以1:10000倍稀释，对金黄葡萄球菌只以1:100倍稀释。以上按规定加人相应的药液、菌液和MH肉汤，放人37℃恒温培养箱中培养24h后观察，计算后结果见表1。

1.2.4联合药敏试验
根据所测得的恩诺沙星与硫酸粘菌素对每种菌株的MIC值，采用微量稀释棋盘法进行药物的联合抗菌试验，每种菌株重复棋盘2次，采用5 xll孔微量稀释板，每2块合并为1块，即为10 x 11孔。2种药物分别从1/8 MIC到2 MIC对倍稀释。具体方法是:恩诺沙星沿X轴稀释(除Y一1柱外)“+”管不加，每管50协L;硫酸粘菌素沿Y轴稀释，(除x一1排外)“一”管不加，每管50μL;“一”管加培养基200林L，“+”管加培养基100μL;除“一”管外，Y一1柱以及X一l排均加人菌液，每孔50μL;其余各孔加人菌液100μL;37CC培养18一20h。
读取结果:各药最佳浓度，分别读取2点，点1为恩诺沙星联用的最低MIC;点2为硫酸粘菌素联用的最低MIC，分别记为MICA和MICB。沿0点角平分线上各孔均为等效中点，由此点对应X轴上点位Ml-CA及MICB。结果见表2。

2.3.2对比试验结果分析
复方恩诺沙星注射液与2.5%恩诺沙星注射液相比较，同样稀释10 000倍后，比较对大肠杆菌、沙门氏菌的抑菌效果，复方恩诺沙星明显强于单方恩诺沙星，对2种菌的抑制能力分别增强64倍和16倍;复方恩诺沙星对巴氏杆菌的抑菌效果也增强4倍;但对金黄葡萄球菌的抑制效果仅呈现相加作用。
3结论与讨论
3 .1恩诺沙星与硫酸粘菌素的药敏试验
恩诺沙星对4种受试菌的MIC值显示，对大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌以及金黄葡萄球菌的抑菌效果一般，其MIC值均在1.5一0.7μg//mL之间，表明恩诺沙星的抗菌谱广，能作为广谱抗菌药物使用，但其抑菌强度偏低。
硫酸粘菌素对4种受试菌的MIC值显示，对大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌的MIC值均在0.375林岁mL，抑菌效果略高于恩诺沙星;对于金黄葡萄球菌的MIC值达到50μg/mL，比恩诺沙星对金黄葡萄球菌的MIC高出33倍，显示该菌对硫酸粘菌素极不敏感，同时表明硫酸粘菌素抗菌谱比恩诺沙星窄。
3 .2恩诺沙星与硫酸粘菌素的联合药敏试验
    恩诺沙星与硫酸粘菌素联合用药试验结果显示，对大肠杆菌、沙门氏菌和巴氏杆菌的RC指数均小于0.5，呈现出协同作用，表明硫酸粘菌素对恩诺沙星具有显著的协同作用;其联用后对金黄葡萄球菌的nc值也在0到1之间，呈相加作用，抑菌效果仍有所提高。两药联用呈现较好的协同作用，其原因可能是由于两者的作用机理不一样，并相互影响。硫酸粘菌素首先吸附在细菌细胞璧，结合细胞膜中脂蛋白的游离磷酸盐，使细胞成分(嗓岭和嚓咙)脱逸，从而导致细胞死亡，故具有杀菌作用;而恩诺沙星的作用机理是能与细菌DNA回旋酶亚基A结合，从而抑制了酶的切割与连结功能，阻止了细菌DNA的复制，而呈现抗菌作用，也许正是因为硫酸粘菌素引起细胞壁的破损，为恩诺沙星进人细胞内提供了条件，从而导致其抗菌作用明显提高。对于金黄葡萄球菌，两药联合后的抑菌效果仅呈相加作用，主要原因可能是因为金黄葡萄球菌对硫酸粘菌素不敏感，不能破坏其细胞壁，也就不能为恩诺沙星进人细菌细胞内创造条件。
3.3恩诺沙星与复方恩诺沙星的对比试验
    通过对比试验，复方恩诺沙星比恩诺沙星对大肠杆菌、沙门氏菌及巴氏杆菌的抑制作用都呈现出成倍的增加，分别达到了64倍、16倍和4倍;大大提高了恩诺沙星的抗菌效能;表明对大肠杆菌、沙门氏菌及巴氏杆菌的感染性疾病采用恩诺沙星与硫酸粘菌素联用进行治疗时，可减少药物单用时的剂量，并克服恩诺沙星抗菌活性降低的缺点。笔者根据临床上恩诺沙星的法定使用浓度2.5%，从不改变恩诺沙星的使用剂量出发，添加0.5%的硫酸粘菌素以提高其抗菌效果，结果显示硫酸粘菌素对恩诺沙星有明显的增效作用。由于硫酸粘菌素使用剂量很小(常规为2.5%)，有利于降低其毒性和降低药物成本，因此本制剂有必要进行药学、药理毒理、临床相关试验，以使其向临床推广。