沈学优 童裳伦 陈 立 王 琴
(浙江大学西溪校区环境科学系 杭州310028)
1 前 言
3,4 二羟苯丙氨酸又名多巴,是酪氨酸代谢的中间产物,在神经系统中对精神活动和行为以及大脑皮层的醒觉和睡眠节律有重要的作用[1].而且左旋多巴是目前治疗震颤麻痹症的基本药物,以往测定这类含苯丙氨酸的物质时多用自然荧光[2],该法灵敏度低,干扰严重,为提高选择性有人采用同步荧光法测定[3].本研究发现稀土铽离子能与3,4 二羟苯丙氨酸发生荧光反应,从而把稀土离子荧光探针法引入氨基酸的测定,建立了简便、快速、选择性好、灵敏度高的测定新方法,其检出限可达6.0×10-9ｍｏｌ/Ｌ.
2 实验部分
2.1 试剂
3,4 二羟苯丙氨酸溶液:将一定量的3,4 二羟苯丙氨酸加几滴2ｍｏｌ/Ｌ盐酸,溶于少量蒸馏水中,然后定容于100ｍｌ容量瓶中,制成0.01ｍｏｌ/Ｌ的贮备液.
Ｔｂ(Ⅲ)标准溶液:称取一定量的Ｔｂ4Ｏ7(光谱纯或含量大于99.9%),滴加1∶1盐酸数滴,小心加热使其溶解,待蒸发水分近干,用蒸馏水定容至100ｍＬ,制成1.0×10-2ｍｏｌ/Ｌ的贮备液.使用时,用蒸馏水按所需浓度进行适当稀释即可.缓冲液:将50ｇ六次甲基四胺(ＨＭＡ)溶于500ｍＬ蒸馏水中,用盐酸调ｐＨ至6.8～7.4.
2.2 仪器
ＲＦ-540荧光分光光度计(日本岛津),ｐＨＳ 2酸度计(上海雷磁仪器厂).
2.3 实验方法
在25ｍＬ比色管中,分别加入1ｍＬ3,4 二羟苯丙氨酸溶液(1.0×10-7～5.0×10-4ｍｏｌ/Ｌ),1ｍＬＴｂ3+标准溶液(1.0×10-3ｍｏｌ/Ｌ)以及1ｍＬ10%的六次甲基四胺(ＨＭＡ)缓冲液,然后用蒸馏水稀释定容至10ｍＬ,摇匀并放置15～20ｍｉｎ.在激发波长为300ｎｍ,发射波长为490或550ｎｍ处,用1ｃｍ比色池测定其荧光强度.
3 结果与讨论
3.1 荧光光谱
试验了20种常见氨基酸与3,4 二羟苯丙氨酸的自然荧光,发现只有苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、3,4 二羟苯丙氨酸存在着自然荧光,它们的激发和发射波长相近,荧光光谱较宽,因而相互干扰.同时对上述21种常见氨基酸与Ｔｂ(Ⅲ)络合发光情况进行了研究,实验表明只有以下四种氨基酸有Ｔｂ(Ⅲ)的特征荧光:3,4 二羟苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸,但酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸只产生很弱的荧光,只有3,4 二羟苯丙氨酸与Ｔｂ3+产生强的荧光,本文详细研究了3,4 二羟苯丙氨酸与Ｔｂ3+的络合发光情况.其激发和发射光谱如图1所示.
由图1可见,用上述波长直接激发ＴｂＣｌ3的水溶液,不能检测到Ｔｂ3+的特征荧光,表明体系中Ｔｂ3+的发光是由于形成络合物后,配位体将吸收的能量传递给中心离子Ｔｂ(Ⅲ)的结果.Ｔｂ(Ⅲ)-3,4 二羟苯丙氨酸体系的发射波长490ｎｍ与550ｎｍ,分别相应于Ｔｂ3+的5Ｄ4能级向7Ｆ6及7Ｆ5能级的跃迁.
3.2 体系荧光强度的影响因素
3.2.1 ｐＨ及不同缓冲体系的影响
试验了不同ｐＨ对体系荧光强度的影响,结果表明ｐＨ在6.8～7.4范围内,体系的荧光强度最大.缓冲溶液的种类对体系荧光强度也有重要影响.本文试验了以下几种缓冲溶液:ＮａＡｃ-ＨＡｃ,ＮＨ4Ａｃ,六次甲基四胺(10%)-ＨＣｌ,ＮＨ3-ＮＨ4Ｃｌ,结果表明,1ｍＬ六次甲基四胺(10%)-ＨＣｌ缓冲溶液效果最佳.3.2.2 Ｔｂ(Ⅲ)离子浓度的影响在3,4 二羟苯丙氨酸的浓度为1.0×10-5ｍｏｌ/Ｌ,2.0×10-6ｍｏｌ/Ｌ,4.0×10-7ｍｏｌ/Ｌ以及6.0×10-8ｍｏｌ/Ｌ时,试验了Ｔｂ(Ⅲ)的浓度对体系荧光强度的影响.结果表明,Ｔｂ(Ⅲ)浓度在1.0×10-4～1.4×10-4ｍｏｌ/Ｌ范围内,均可使荧光强度达到最大且保持稳定.实验中选用Ｔｂ(Ⅲ)浓度为1.0×10-4ｍｏｌ/Ｌ.
3.2.3 溶剂的影响
溶剂对体系荧光强度有较大的影响,结果如表1所示.由表1可见,当醇类取代水作为溶剂时,体系的激发峰将向短波方向移5～10ｎｍ,且以甲醇效果最好,以甲醇做溶剂体系的灵敏度比水为溶剂提高六倍左右.
3.2.4 其它氨基酸的影响
在3,4 二羟苯丙氨酸的浓度为1.0×10-6ｍｏｌ/Ｌ情况下,试验了其它氨基酸对Ｔｂ(Ⅲ)-3,4 二羟苯丙氨酸体系荧光强度的影响.在荧光强度的相对误差为±5%范围内,其它氨基酸的最大不干扰倍数如下:Ｌ-Ｐｈｅ(15),Ｌ-Ｌｙｓ(8),Ｌ-Ａｌａ(20),Ｌ-Ａｓｐ(20),ＤＬ-Ｔｈｒ(10),Ｌ-Ｔｒｐ(2),ＤＬ-Ｍｅｔ(10),Ｌ-Ｖａｌ(10),Ｌ-Ｓｅｒ(40),Ｌ-Ｇｌｕ(7),Ｌ-Ｃｙｔ(10),Ｌ-Ｃｙｓ(10),ＤＬ-Ｇｌｎ(50),Ｌ-Ｌｅｕ(50),Ｌ-Ｔｙｒ(20),Ｌ-Ｈｉｓ(2),Ｌ-Ｇｌｙ(20).由此可见,大多数氨基酸对3,4 二羟苯丙氨酸测定无干扰或干扰较小.
3.3 线性范围与检出限
在最佳测试条件下,按操作步骤绘制了3,4 二羟苯丙氨酸的工作曲线,如图2所示.结果表明,3,4 二羟苯丙氨酸浓度在2.0×10-8～5.0×10-5ｍｏｌ/Ｌ范围内与体系的荧光强度呈线性关系,相关系数为0.9992,其检出限为6.0×10-9ｍｏｌ/Ｌ(Ｓ/Ｎ=2).
3.4 分析应用
3.4.1 回收试验
在体系最佳测试条件下,进行了混合样品的回收试验,结果如表2所示,混合样品的回收率分别为103.6%与102.4%.
3.4.2 样品分析
实验测定了左旋多巴片(广西东兰制药厂生产),其实验步骤如下:随机地取左旋多巴片5片,研细,称取0.3672ｇ溶于水,并定容于100ｍＬ容量瓶中,稀释2000倍,用标准加入法进行测定,并与自然荧光法的结果进行比较,结果列于表3中.
参考文献
1 沈同等编.生物化学,北京:高等教育出版社,1987,589
2 陈国珍编.荧光分析法,北京:科学出版社,1990,491
3 黄贤智,许金钩等.分析化学,1987,3(3):199
|
