刘中华,周 平,邓延倬(武汉大学化学与分子科学学院,武汉430072)
毛细管电泳分离ＤＮＡ片段常采用凝胶介质和无胶筛分介质。凝胶介质,如聚丙烯酰胺凝胶[1,2]、琼脂糖[3]等分离效率高,但凝胶毛细管柱制备困难,寿命较短,重现性较差,限制了其在ＤＮＡ分析中的运用[4]。无胶筛分介质由线性高分子化合物溶液组成,毛细管柱制备相对简单,操作简便。常用的无胶筛分介质有线性聚丙烯酰胺[5,6]、纤维素衍生物[7,8]、聚乙二醇[9]、聚环氧乙烷[10]等。近来,聚Ｎ 取代丙烯酰胺由于稳定性好、亲水性强的优点,利用其作为筛分介质,获得了较好的分离效果[11,12]。本文以聚Ｎ 异丙基丙烯酰胺及甘露醇组成无胶筛分介质,对ΦΧ174/ＨａｅⅢＤＮＡ片段进行了分离,并对其分离机理进行了探讨。
1 实验部分
1.1 仪器及试剂
激光诱导荧光毛细管电泳装置为实验室组装,由高压电源、激光器、光电倍增管、Ｂｏｘｃａｒ积分仪、计算机等部分组成[13]。Ｎ 异丙基丙烯酰胺、硅油(γ ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ,ＭＡＰＳ)为Ａｌｄｒｉｃｈ公司产品,丙烯酰胺为ＧＩＢＣＯ公司产品,ΦΧ174/ＨａｅⅢ酶切ＤＮＡ片段为ＴａＫａＲａ生物工程(大连)有限公司产品,Ｎ,Ｎ,Ｎ′,Ｎ′ 四甲基乙二胺(ＴＥＭＥＤ)、过硫酸铵(ＡＰＳ)、三羟基氨基甲烷(Ｔｒｉｓ)、硼酸、ＥＤＴＡ为国产分析纯。毛细管内壁涂层:熔硅毛细管(河北永年光导纤维厂)长40ｃｍ(有效长度32ｃｍ),内径75μｍ,外径375μｍ。依次用1ｍｏｌ/Ｌ氢氧化钠、0.1ｍｏｌ/Ｌ盐酸、双蒸水清洗,再用甲醇冲洗,Ｎ2吹干。管内填充硅油(50%ＭＡＰＳ甲醇溶液),37℃过夜后键合4%线性聚丙烯酰胺,最后用甲醛交联[14]。
1.2 筛分介质的制备
聚Ｎ 异丙基丙烯酰胺(ＰＮＩＰ)的配制:将6ｇＮ 异丙基丙烯酰胺溶入100ｍＬ1×ＴＢＥ缓冲液中,通高纯氮气去氧,加入0.036%(ｍ/Ｖ)ＡＰＳ和0.07%(Ｖ/Ｖ)ＴＥＭＥＤ,4℃聚合48ｈ。0.5%、1%、2%和3%ＰＮＩＰ由6%ＰＮＩＰ用1×ＴＢＥ缓冲液稀释得到。
1.3 毛细管电泳分离方法
进样前,毛细管用0.1ｍｏｌ/Ｌ氢氧化钠溶液及1×ＴＢＥ溶液各冲洗5ｍｉｎ,再注入筛分介质预电泳10ｍｉｎ。采用负极电动进样,10ｋＶ进样8ｓ,正极端激光诱导荧光检测。
2 结果与讨论
2.1 甘露醇对筛分作用的影响
ΦΧ174/ＨａｅⅢ含有11个酶切ＤＮＡ片段,分别为72、118、194、234、271、281、310、603、872、1078、1353ｂｐ。以3%ＰＮＩＰ作为筛分介质分离ΦΧ174/ＨａｅⅢ,小片段未分开,大片段也未达到基线分离,分离效果差(图1ａ)。筛分介质中添加2%甘露醇后,分离效果明显改善(图1ｂ)。当加入6%甘露醇时,除271、281ｂｐ外的所有片段均实现基线分离(图1ｃ)。加入8%甘露醇时,ＤＮＡ片段迁移时间过长,分离效果没有明显增加。以3%ＰＮＩＰ和6%甘露醇组成的混合筛分介质粘度较小,而且聚Ｎ 取代丙烯酰胺在碱性条件下稳定性好,因此,这种混合介质可望成为较好的ＤＮＡ分离介质。
2.2 ＰＮＩＰ浓度对筛分作用的影响
未添加甘露醇的ＰＮＩＰ介质在0.5%至6%范围内分离ΦΧ174/ＨａｅⅢ片段效果均较差,高于6%的ＰＮＩＰ粘度较大,难以操作。分别在0.5、1、2、3和6%ＰＮＩＰ中添加2、4、6和8%甘露醇作为筛分介质对ΦΧ174/ＨａｅⅢ片段进行了分离研究,结果发现,对于0.5%和1%ＰＮＩＰ,加入甘露醇后分离效果的改善并不明显,低于310ｂｐ的小片段ＤＮＡ不能分开,其原因主要是ＰＮＩＰ筛分介质的浓度太低,筛分效果差。向2%ＰＮＩＰ加入甘露醇后分离效果明显改善,只是低于310ｂｐ的小片段ＤＮＡ未能基线分离。3%ＰＮＩＰ加入甘露醇后除271、281ｂｐ片段外均实现基线分离。较之3%ＰＮＩＰ,6%ＰＮＩＰ加入甘露醇后分离效果没有明显改善,且其粘度大,难以进样和清洗毛细管,ＤＮＡ分子迁移时间过长。图2以603ｂｐ为例说明在不同筛分介质中迁移时间的变化:随着ＰＮＩＰ浓度的增加,迁移时间增加;在ＰＮＩＰ浓度不变的条件下,甘露醇浓度增大,ＤＮＡ片段迁移时间加长。
2.3 作用机理探讨
ＤＮＡ在无胶筛分介质中的分离机理尚有争论,通常认为“筛分孔径”的大小是影响分离效果的重要因素。在线性ＰＮＩＰ分子中添加甘露醇,可以明显改善ΦΧ174/ＨａｅⅢＤＮＡ片段的分离,尤其是小片段。这表明随着甘露醇的加入,筛分介质的筛分孔径逐渐减小到适合这些片段的分离。甘露醇含有对称的羟基,通过ＴＢＥ缓冲液中硼酸根的交联作用,能与多羟基物质如羟丙基甲基纤维素(ＨＭＰＣ)发生交联,从而改善ＨＭＰＣ的筛分效果[15]。蔗糖添加于羟乙基纤维素中亦有类似的增强效果[16]。甘露醇在ＰＮＩＰ筛分介质中与硼酸分子作用,从而调整筛分孔径。甘露醇与硼酸分子反应时释放氢离子,因此甘露醇浓度增加,筛分介质的电流增大。
2.4 ＰＣＲ扩增产物的检测
以3%ＰＮＩＰ和6%甘露醇组成混合筛分介质对果蝇一段功能基因的ＰＣＲ扩增产物进行分离鉴定,电泳结果如图3所示。利用图1中ＤＮＡ片段迁移时间与碱基对数目的关系可以推出ＰＣＲ扩增产物的长度为600ｂｐ,与实际长度610ｂｐ基本相符。
参考文献:
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