马晓梅1 唐小真2
(1青岛大学化学化工与环境学院 青岛 266071) (2上海交通大学化学化工学院 上海 200240)
聚(Ｎ 异丙基丙烯酰胺)(ＰＮＩＰＡＭ)微凝胶由于其体积相转变温度(约34℃)接近人体的正常体温、尺寸小以及响应速度快等特点在生物医用领域(如药物的控制释放,生物反应、细胞培养等的温控载体,生物分离等)显示出良好的应用前景[1～4].但是,温敏性微凝胶作为药物载体时,如果相转变温度低于人体正常体温,则没有实际意义[5];很多与人体生命有关的生物反应必须在约37℃条件下进行,这就要求作为温控载体的温敏性材料的ＶＰＴＴ(ｖｏｌｕｍｅ ｐｈａｓｅｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ,体积相转变温度)必须与反应条件匹配;温敏性微凝胶作为生物分离材料时,通常要求材料具有一定的选择识别性,因此分子中常常需要引入适当的功能性基团,这些功能性基团能通过非共价键复合作用选择性识别或结合特定的生物分子,从而达到生物分离、诊断等目的.所以,为了满足生物材料的要求,常需要对温敏性的ＰＮＩＰＡＭ微凝胶进行改性,以调节其ＶＰＴＴ,或使材料兼具温敏性与功能性.含有活性羟基的聚甲基丙烯酸酯类是常用的生物医用材料[6],这一类聚合物不仅生物相容性好、易降解、毒性低[7,8],而且分子中含有的功能性羟基能通过非共价键复合作用选择性识别或结合特定的生物分子(如酶、氨基酸及其它能形成氢键的物质),从而起到生物分离、诊断等作用;而且通常它们具有不同的亲水性(决定于链长),因此,通过选择链长不同(从而亲水性不同)的单体,或者通过调节同一单体在微凝胶中的比例,可以达到调节ＰＮＩＰＡＭ微凝胶ＶＰＴＴ的目的.我们曾报道利用二缩三乙二醇单甲基丙烯酸酯(ＴＲＥＧＭＡ)作为共聚单体与ＮＩＰＡＭ共聚制备温敏性微凝胶,结果表明,所制备的微凝胶具有较好的温敏性,且ＶＰＴＴ较纯ＰＮＩＰＡＭ微凝胶更接近人体正常体温,在生物材料方面显示出良好的应用前景[9].本研究将选择链长较短的甲基丙烯酸羟乙酯(ＨＥＭＡ)和链长较长的多缩乙二醇单甲基丙烯酸酯(ＰＥＧＭＡ)作为共聚单体,与温敏性单体ＮＩＰＡＭ共聚,制备温敏性与功能性兼备的微凝胶,比较不同长度侧链对微凝胶去溶胀性能的影响.
1 实验部分
1.1 试剂与仪器
甲基丙烯酸羟乙酯(ＨＥＭＡ),工业级,上海珊瑚化工厂;用前减压蒸馏除去阻聚剂.多缩乙二醇单甲基丙烯酸酯(ＰＥＧＭＡ),Ａｌｄｒｉｃｈ,平均分子量(Ｍｎ)为526,直接使用.ＮＩＰＡＭ(英国Ａｃｒｏｓ产品,纯度为99%),直接使用;Ｎ,Ｎ′ 亚甲基双丙烯酰胺(ＢＡ)(Ａｌｄｒｉｃｈ,电泳级)、过硫酸钾(ＫＰＳ)(分析纯,中国医药集团上海医药试剂公司,进口分装),均直接使用.用于合成及透析的水均为3次蒸馏水;用于动态光散射的水为超纯水.ＭＥＲＣＵＲＹＰｌｕｓ400核磁共振仪,美国Ｖａｒｉａｎ公司.透射电子显微镜,ＪＥＭ 100Ｘ(Ⅱ)型透射电子显微镜,加速电压为100ｋＶ,日本电子公司.ＷｙａｔｔＱＥＬＳ型动态光散射仪,美国Ｗｙａｔｔ公司.Ｓｐｅｃｔｒａｌ 1 70型紫外 可见分光光度仪,配有加热装置(ＧＢＣ热池),温度稳定性为±0 1℃,澳大利亚ＧＢＣ公司.Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒＰｙｒｉｓ 1型差热分析仪,美国ＰＥ公司.
1.2 微凝胶的制备
微凝胶的制备及纯化参考文献[9],ＰＥＧＭＡ改性微凝胶(Ｐ(ＮＩＰＡＭ ｃｏ ＰＥＧＭＡ))及ＨＥＭＡ改性微凝胶(Ｐ(ＮＩＰＡＭ ｃｏ ＨＥＭＡ))的编号及具体投料情况见表1.
1.3 微凝胶的表征
1.3.1 结构表征
将透析后的微凝胶分散液冷冻干燥后,重新分散在Ｄ2Ｏ中,测定20℃时的1Ｈ ＮＭＲ谱图.
1.3.2 形态表征
将透析后的微凝胶用2ｗｔ%磷钨酸水溶液染色后,取适量微凝胶分散液,滴在涂有聚乙烯醇缩甲醛的铜网上(300目),在恒定温度下干燥24ｈ.用透射电子显微镜(ＴＥＭ)观察微凝胶的形态与尺寸分布.
1.3.3 去溶胀性能研究
采用动态光散射法(ＤＬＳ)、浊度法及示差扫描量热法(ＤＳＣ)考察微凝胶的去溶胀性能.所用仪器及测试方法同文献[9].
2 结果与讨论
2.1 微凝胶的结构
微凝胶的结构通过1Ｈ ＮＭＲ得到证实.图1所示为Ｐ(ＮＩＰＡＭ ｃｏ ＰＥＧＭＡ)微凝胶的1Ｈ ＮＭＲ谱图.其中,峰ａ主要对应为Ｎ 异丙基中甲基上氢原子的峰;宽的ｂ、ｃ峰为聚合物骨架氢原子的峰;ｄ峰为—(—ＯＣＨ2ＣＨ2—)10—基中氢原子的峰;ｅ峰为Ｎ 异丙基中次甲基上氢原子的峰.从图中可以看出,峰ｄ与峰ｅ(或峰ａ)的积分面积比随着ＰＥＧＭＡ投料比例的增加而增加,说明ＰＥＧＭＡ与ＮＩＰＡＭ能够较好地共聚合.
图2为Ｐ(ＮＩＰＡＭ ｃｏ ＨＥＭＡ)微凝胶的1Ｈ ＮＭＲ谱图.其中,峰ａ主要对应为Ｎ 异丙基中甲基上氢原子的峰.宽的ｂ、ｃ峰对应为聚合物骨架氢原子的峰.对于ＨＥＭＡ0,图中的ｅ峰对应为Ｎ 异丙基中次甲基上氢原子的峰.从图可以看出,对于ＨＥＭＡ8、ＨＥＭＡ14和ＨＥＭＡ20,ｅ峰逐渐变宽,且变为两个相互重叠的峰,这是由于ＰＨＥＭＡ侧基中亚甲基上的氢原子与Ｎ 异丙基中次甲基上氢原子的峰发生部分重叠造成的;另外,从图2还可以发现,随着ＨＥＭＡ投料比例的增加,1Ｈ ＮＭＲ谱图中出现了一个新的宽峰(峰ｆ),峰ｆ主要对应为ｐＨＥＭＡ侧基中羟基氢原子的峰.从图2可以看出,峰ｆ与峰ａ的积分面积比随着共聚单体ＨＥＭＡ投料比例的增加而增加,说明ＨＥＭＡ能够较好地与ＮＩＰＡＭ共聚形成微凝胶;ＨＥＭＡ的投料比例越高,结合到微凝胶中的ＨＥＭＡ越多.但对于ＨＥＭＡ4未观察到ｆ峰,ｅ峰亦未出现明显叠加,这可能是由于ＨＥＭＡ的投料比例较低、信号太弱的缘故.
2.2 微凝胶的形态
典型的Ｐ(ＮＩＰＡＭ ｃｏ ＰＥＧＭＡ)、Ｐ(ＮＩＰＡＭ ｃｏ ＨＥＭＡ)微凝胶的ＴＥＭ照片如图3所示.ＴＥＭ结果表明,所制备的微凝胶均具有较规则的球型形态和较窄的粒径分布.单从ＴＥＭ照片看,微凝胶Ｍ ＨＥＭＡ4和Ｍ ＨＥＭＡ14的颗粒大小差异不大,但图片显示的并非微凝胶的真实尺寸.因为ＴＥＭ图片中的微凝胶是将溶胀态的微凝胶分散液于一定温度下干燥后进行测试的.图中显示的微凝胶的表观尺寸与多种因素有关,如微凝胶的溶胀性能以及微凝胶网络的疏松程度,它们决定了微凝胶在铜网上的铺展程度;在干燥过程中不同微凝胶的脱水程度通常也有较大差异,取决于微凝胶的分子结构及分子间相互作用等,也将造成微凝胶的表观尺寸与真实尺寸的差异.所以,ＴＥＭ法往往不能反映溶胀态微凝胶的真实尺寸.
2.3 微凝胶的去溶胀性能
2.3.1 ＤＬＳ结果
ＰＥＧＭＡ与ＨＥＭＡ改性微凝胶的流体力学半径(Ｒｈ)随温度的改变情况示于图4.从图中可以看出,当温度升高到一定程度时,微凝胶的Ｒｈ急剧减小,说明所制备的微凝胶均具有较好的温敏性.微凝胶的相转变温度(ＶＰＴＴ),即粒径发生急剧变化时的温度,可以通过粒径的一阶导数与温度的关系曲线求得,或取粒径变化较大的温度区间的中间温度作为ＶＰＴＴ[10].从图4(ａ)可以看出,亲水性单体ＰＥＧＭＡ的引入使得ＰＮＩＰＡＭ微凝胶的ＶＰＴＴ向高温方向位移;ＰＥＧＭＡ引入得越多,ＶＰＴＴ向高温方向位移得也越多.但图4(ｂ)显示,引入亲水单体ＨＥＭＡ后,微凝胶的ＶＰＴＴ向低温方向而不是高温方向位移;ＨＥＭＡ投料比越高,ＶＰＴＴ向低温方向位移得越多.微凝胶的ＶＰＴＴ取决于微凝胶体系中亲水基团与水分子之间的氢键相互作用、亲水基团之间的氢键相互作用以及疏水基团的疏水缔合作用[11].ＰＥＧＭＡ的引入在Ｐ(ＮＩＰＡＭ ｃｏ ＰＥＧＭＡ)微凝胶中引入了强亲水性侧基—(—ＯＣＨ2ＣＨ2—)10—ＯＨ,强亲水性侧基—(—ＯＣＨ2ＣＨ2—)10—ＯＨ与水分子间存在较强的氢键作用,但与酰胺基的氢键作用较弱,结果—(—ＯＣＨ2ＣＨ2—)10—ＯＨ与水分子间的氢键作用增强了微凝胶与水的亲和作用,从而增强了微凝胶的热力学稳定性,因此微凝胶在较高的温度下发生ｃｏｉｌ ｔｏ ｇｌｏｂｕｌｅ的转变[12],相转变温度升高;ＰＥＧＭＡ的投料比越高,引入的强亲水性侧基—(—ＯＣＨ2ＣＨ2—)10—ＯＨ越多,微凝胶的热力学稳定性越好,相转变温度越高.但是引入ＰＥＧＭＡ后,微凝胶的相转变温度范围变得比较宽,体积相转变变得比较连续.这是由于亲水性的侧基—(—ＯＣＨ2ＣＨ2—)10—ＯＨ降低了ＮＩＰＡＭ链段中异丙基之间的疏水缔合作用,从而导致Ｐ(ＮＩＰＡＭ ｃｏ ＰＥＧＭＡ)微凝胶发生比较连续的相转变.
引入亲水单体ＨＥＭＡ与通常的引入亲水性单体使ＶＰＴＴ升高的规律[11]不同,这可能是由于极性的侧基羟乙基与羟乙基之间、以及羟乙基与酰胺基之间存在较强的分子间氢键相互作用,降低了酰胺基与水分子间的相互作用;换句话说,极性ＨＥＭＡ的引入降低了微凝胶中亲水基团的数目,从而使得微凝胶与水的亲和作用降低,热力学稳定性降低,因此,微凝胶在较低的温度下发生收缩,ＶＰＴＴ降低.
另外,图4(ｂ)中,随着温度的升高,ＨＥＭＡ含量不同的微凝胶的粒径变化程度差异较大.其中,Ｍ ＨＥＭＡ0和Ｍ ＨＥＭＡ4的粒径变化较缓慢,Ｍ ＨＥＭＡ8、Ｍ ＨＥＭＡ14和Ｍ ＨＥＭＡ20变化较快,总的趋势是随着ＨＥＭＡ含量的增加微凝胶的收缩呈现加快的趋势.粒径的这种变化主要是由于温度变化时,因分子间相互作用的差异而导致的微凝胶的热力学稳定性不同而造成的.表2列出了Ｐ(ＮＩＰＡＭ ｃｏ ＰＥＧＭＡ)与Ｐ(ＮＩＰＡＭ ｃｏ ＨＥＭＡ)微凝胶的去溶胀比[9]计算结果.从表中数据可以看出,在Ｐ(ＮＩＰＡＭ ｃｏ ＰＥＧＭＡ)微凝胶中引入亲水性单体ＰＥＧＭＡ后,微凝胶的去溶胀比随着ＰＥＧＭＡ投料比例的增加而降低,这是由于ＰＥＧＭＡ的引入在微凝胶分子中引入了强亲水性侧基—(—ＯＣＨ2ＣＨ2—)10—ＯＨ,温度升高时,强亲水性侧基—(—ＯＣＨ2ＣＨ2—)10—ＯＨ在很大程度上阻碍了ＮＩＰＡＭ链段中异丙基的疏水缔合;ＰＥＧＭＡ的投料比越高,—(—ＯＣＨ2ＣＨ2—)10—ＯＨ侧基的含量越高,对异丙基的疏水缔合作用阻碍越大,微凝胶的去溶胀越不完全,去溶胀比越低,所以,随着ＰＥＧＭＡ投料比例的增加,Ｐ(ＮＩＰＡＭ ｃｏ ＰＥＧＭＡ)微凝胶的去溶胀比单调下降.
表2结果显示,当引入ＨＥＭＡ时,Ｐ(ＮＩＰＡＭ ｃｏ ＨＥＭＡ)微凝胶的去溶胀比随着ＨＥＭＡ投料比的增加先是增加然后降低,Ｍ ＨＥＭＡ8的去溶胀比达到最大.这是由于ＨＥＭＡ的引入,在微凝胶分子中引入了极性侧基—ＯＣＨ2ＣＨ2—ＯＨ,—ＯＣＨ2ＣＨ2—ＯＨ基之间以及—ＯＣＨ2ＣＨ2—ＯＨ基与酰胺基之间存在较强的氢键相互作用,导致微凝胶的亲水性降低,亲水性的降低在一定程度上对于异丙基的疏水缔合是有利的,因此,使得Ｐ(ＮＩＰＡＭ ｃｏ ＨＥＭＡ)微凝胶的去溶胀比增加;但当ＨＥＭＡ投料比较高时,微凝胶的亲水性降低较大,水合程度较差,温度升高时微凝胶排出的水较少,Ｐ(ＮＩＰＡＭ ｃｏ ＨＥＭＡ)微凝胶的去溶胀比增加不大.另外,微凝胶收缩时外层网络结构的紧密程度对微凝胶的去溶胀比也有一定的影响.
2.3.2 浊度结果
图5所示为Ｐ(ＮＩＰＡＭ ｃｏ ＰＥＧＭＡ)和Ｐ(ＮＩＰＡＭ ｃｏ ＨＥＭＡ)微凝胶的浊度随温度的变化情况.从图可以看出,改性微凝胶与未改性微凝胶相似,温度升高时,浊度在一定的温度范围急剧增加,说明改性后微凝胶仍保留了温敏性.微凝胶的浊度主要决定于微凝胶内部空隙所含的水量,它揭示了微凝胶 水复合体系与体相水之间折光指数的差值.当温度在体积相转变温度以下时,微凝胶处于溶胀状态,微凝胶 水复合体系与体相水之间的折光指数相差小,微凝胶的浊度小;微凝胶的亲水性越强,微凝胶 水复合体系与体相水之间的折光指数相差越小,浊度越小.随着温度的增加,由于氢键的破坏及异丙基之间的疏水缔合作用增强,微凝胶由伸展的网络变为蜷曲的硬球,水被排出微凝胶网络,微凝胶 水复合体系与体相水之间折光指数差增加,微凝胶的浊度亦随之增加.
改性微凝胶的相转变温度可以通过浊度的一阶导数与温度的关系曲线(略)得到.用该方法求得的Ｍ ＰＥＧＭＡ0、Ｍ ＰＥＧＭＡ2、Ｍ ＰＥＧＭＡ4以及Ｍ ＰＥＧＭＡ8的ＶＰＴＴ分别为37.0℃、39.0℃、40.5℃和45.4℃,即引入ＰＥＧＭＡ后,Ｐ(ＮＩＰＡＭ ｃｏ ＰＥＧＭＡ)微凝胶的ＶＰＴＴ向高温方向位移;ＰＥＧＭＡ引入得越多,ＶＰＴＴ向高温方向位移得越多.Ｍ ＨＥＭＡ0、Ｍ ＨＥＭＡ4、Ｍ ＨＥＭＡ8、Ｍ ＨＥＭＡ14以及Ｍ ＨＥＭＡ20的ＶＰＴＴ分别为37.0℃、35.9℃、35.0℃、33. 9℃和32.0℃,即ＨＥＭＡ的引入使得Ｐ(ＮＩＰＡＭ ｃｏ ＨＥＭＡ)微凝胶的ＶＰＴＴ向低温方向位移,ＨＥＭＡ的投料比越高,相转变温度降低得越多.说明浊度法测得的结果与ＤＬＳ结果一致.
2.3.3 ＤＳＣ结果 图6所示为微凝胶分散液的ＤＳＣ扫描曲线.图6(ａ)为Ｍ ＰＥＧＭＡ0与Ｍ ＰＥＧＭＡ2的ＤＳＣ曲线,对于Ｍ ＰＥＧＭＡ4和Ｍ ＰＥＧＭＡ8,由于没有观察到明显的吸热峰,所以图中未列出.微凝胶的ＤＳＣ曲线与微凝胶的去溶胀过程有关,在升温ＤＳＣ中,随着温度的升高,微凝胶吸收能量后,水分子与微凝胶亲水基团之间的Ｈ 键被破坏,导致水从微凝胶中排出,微凝胶发生去溶胀.在这个过程中,排出的水越多,微凝胶消耗的能量越多,因此具有较高去溶胀比的微凝胶在去溶胀过程中消耗的能量较多,所以,对于去溶胀比较小的Ｍ ＰＥＧＭＡ4和Ｍ ＰＥＧＭＡ8,去溶胀过程消耗的能量较少,而且由于Ｍ ＰＥＧＭＡ4和Ｍ ＰＥＧＭＡ8体积相转变较宽,加上仪器灵敏性较低,由于这3方面的因素,所以未观察到Ｍ ＰＥＧＭＡ4和Ｍ ＰＥＧＭＡ8的吸热峰.从图6(ａ)可以看出Ｍ ＰＥＧＭＡ2的ＶＰＴＴ高于Ｍ ＰＥＧＭＡ0的ＶＰＴＴ,结果与ＤＬＳ、浊度结果一致.
图6(ｂ)为Ｐ(ＮＩＰＡＭ ｃｏ ＨＥＭＡ)微凝胶分散液的ＤＳＣ扫描曲线.图中的插图为Ｍ ＨＥＭＡ8的ＤＳＣ扫描曲线,由于它的热效应比同系列其它微凝胶的热效应大(与去溶胀比有关),放在同一图中使得其它微凝胶的热效应不明显,所以将它适当缩小置于插图.从图6(ｂ)可以看出,ＨＥＭＡ的引入使得Ｐ(ＮＩＰＡＭ ｃｏ ＨＥＭＡ)微凝胶的ＶＰＴＴ降低,ＨＥＭＡ引入得越多,ＶＰＴＴ降低得越多.表3列出了用不同方法测得的改性微凝胶的ＶＰＴＴ值.虽然由于测试方法的不同导致不同方法测得的ＶＰＴＴ的数值有一些差异,但从表中可以看出,相转变温度的变化趋势是一致的,即ＰＥＧＭＡ的引入使得微凝胶的相转变温度升高,ＰＥＧＭＡ引入得越多,微凝胶相转变温度升高得越多;ＨＥＭＡ的引入使得微凝胶的相转变温度降低,ＨＥＭＡ引入得越多,ＶＰＴＴ下降越多.
综上所述,通过使ＰＥＧＭＡ(ＨＥＭＡ)、ＮＩＰＡＭ和ＢＡ在ＫＰＳ存在下交联共聚制备了侧链含功能性羟基、链长不同的温敏性微凝胶.由于体系中不同的、复杂的相互作用,短侧链—ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ的存在使得Ｐ(ＮＩＰＡＭ ｃｏ ＨＥＭＡ)微凝胶的ＶＰＴＴ降低,长侧链—(—ＣＨ2ＣＨ2Ｏ—)10—Ｈ的引入使得Ｐ(ＮＩＰＡＭ ｃｏ ＰＥＧＭＡ)微凝胶的ＶＰＴＴ升高.
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