李国平，王小林，龚高全，王建华，颜志平，程洁敏，瞿旭东，高虹，
陈颐，刘凌晓
    带药的磁性纳米微球作为栓塞剂国内外已有不少研究。国内外已经用不同骨架成分(如白蛋白，脂质体等)包埋不同抗肿瘤药物制成了各种抗肿瘤磁性纳米微球。本实验所采用的聚N一异丙基丙烯酞胺磁性阿霉素纳米微球(ADM一PNIPAM一Fe3O4)由于PMPAM的温度敏感特性，适用于介人给药方法治疗肿瘤。我们采用ADM一PMPAM一Fe3O;模拟人经动脉化疗栓塞(TACE)方法治疗兔肝脏VXZ转移性肿瘤，研究其作为化疗栓塞药物新剂型的抗肿瘤效果及可行性。
1材料与方法
1.1实验设备与材料
    ①PHIHPS BV 300型数字减影血管造影机(DSA);②Marconi Mx 8000型多排螺旋CT机;③常用腹部外科手术器械及眼科手术器械;④微导管及配套导丝(3F);⑤枷铁硼永磁体4块(每块大小:1 Cmxl。mxlcm，表面磁场强度o.4T);⑥vxZ肿瘤细胞株从美国ATCC公司引进，在动物肝脏种植并传代保存;⑦直径200一500 nm的ADM-pNIpAM一Fe304(每2 mg ADM一pNlpAM一Fe3O4含阿霉素(ADM);⑩CASIO一Ex 240型数码相机;⑩OlymPus BX41型显微镜;⑩麻醉药物:氯胺酮0.1g/2ml，地西伴10 mg/2 ml;⑩肝素钠(12500u/支)，0.1%吐温80生理盐水，2%利多卡因;⑩介人手
术防护服。
1.2实验方法
1.2.1操作技术采用新西兰大白兔，动物体重2.4一3.0 kg，雌雄不拘。将咒只VxZ肝肿瘤兔动物模型随机分成A、B、C、D4组，每组8只，均在无菌条件下切开后腿根部皮肤暴露股动脉，经股动脉插人3F微导管至兔肝动脉(超过胃肠道分支)，在肝动脉造影显示肝内病灶后，尽量超选择插管至肿瘤分支，A组(空白对照组)注入0.1%吐温80生理盐水20耐;B组(ADM组)注人单纯游离阿霉素(lm留kg);C组(ADM一PNIPAM组)缓慢注人ADM-PNlpAM 1 .5 mg/kg(相当于ADM含量约1 mg/kg);D组(ADM一PNIPAM一Fe30;+M组)缓慢注入ADM-pNIpAM一Fe3O4 2mg/kg(相当于ADM含量lmg/kg)，同时取上腹部正中剑突下切口，将兔肝脏充分暴露，将0.4T铆铁硼永磁体垂直置于肿瘤所在肝叶表面，外用生理盐水纱布覆盖，在肿瘤表面外加磁场30 min后，取去磁场，仔细逐层缝扎切口，消毒。各组药物均用0.1%吐温80生理盐水20ml分散，注射时间均为10min。
1.2.2评价标准实验结果评价包括术前后肝脏肿瘤大小、肺转移与否、病理学观测肿瘤生长及坏死情况。检查时间:术前ld、术后14d行CT扫描检测肝脏瘤灶，测量肿瘤体积(V)，取CT扫描病灶最大层面，按公式V=0.5 x a xb计算，其中a为瘤灶长径，b为与a相垂直的短径;术前ld、术后14d同时进行胸部CT扫描，观察两肺肿瘤转移情况。并在术后巧d处死动物立即检查肝内肿瘤大小，腹部、肺部转移情况，取肝脏病灶、肺进行病理学检查，并取C组及D组部分动物胃、脾、肾行病理学检查，病理学检查包括HE染色及普鲁士铁染色。对计量资料作t检验或方差分析，对计数资料进行卡方检验，样本量小的作精确检验。全部资料采用Stata 7.0版统计软件分析，定尸<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1术前后肿瘤大小改变
    各组术前及术后1、14d测得肿瘤大小见表1。

2.3病理表现
    A组VX2肝肿瘤外观呈鱼肉状，呈圆形，生长良好，部分见囊性变，中央坏死不明显，肿块明显大于其他组，向肝叶表面突出，与周围器官组织粘连，3只动物腹壁可见转移肿块，其中1只腹部转移肿块巨大，呈多个大小不等葡萄串样。B组肿块略小于A组，而C组和D组体积相对较小。B、C、D组肿瘤内部均可见坏死，尤其以D组坏死最为明显，并且肿瘤周围形成一圈较厚的结缔组织包膜。镜下可见A组和B组动物肿瘤组织生长良好，少量坏死，C组肿瘤组织散在片状坏死，肿瘤体内见部分淋巴细胞浸润。D组肿瘤细胞绝大部分坏死，肿瘤表面为纤维组织，内部见无结构的坏死组织。在普鲁士铁染色切片中，可见A、B、C组血管内及肿瘤组织内均无明显铁沉积，D组在肿瘤内及在肿瘤周围血管内和组织中均可见到黑色铁颗粒沉积。C组及D组所取动物的胃、脾、肺、肾均未见异位栓塞表现。
3讨论
    TACE已被公认为除外科手术外首选的靶向治疗肝肿瘤的方法。目前临床上还是以碘油作为最常用的末梢栓塞剂。但碘油易造成正常组织的异位栓塞，可加重肝硬化并发生术后并发症13一51。研究能精确到达肿瘤末梢血管部位的带药栓塞剂成为介入医学的另一大发展方向。
    磁性微球、微粒的出现为解决药物能更精确地到达靶部位这一问题提供了新的途径。粒径为纳米级的磁性药物微粒是近年来研究和发展的一种新型靶向给药系统，其靶向作用原理，是将药物和适量具磁活性成分配制于药物稳定系统中，在一定强度的外磁场下经动脉注人到靶部位，由于外加磁场作用，磁性药物纳米微粒逐渐定位于靶部位，使其所含药物得以定位释放，集中在病变部位发挥作用，达到高效、低毒的治疗目的，这种纳米微粒中结合抗肿瘤药物，在肿瘤的靶向给药方面有极大好处，结合介人治疗技术，可以达到超选择靶向治疗的效果阉。
   温度敏感性水凝胶是一种新型智能材料，尽管只有20多年的研究史，但其潜在的应用价值已吸引了国内外众多的研究者。其分为低温收缩型和高温收缩型2种，前者在某一温度附近随温度升高水凝胶体积发生突变式增加，当温度降低时，其体积又缩小;高温收缩型的温度敏感性水凝胶的代表是以PNIPAM为基础的均聚物或共聚物。
    PNIPAM为其单体N一异丙基丙烯酞胺(MPAM)的聚合物，由于其大分子侧链上同时具有亲水性的酞胺基一CONH一和疏水性的异丙基一CH(CH3)2一，使线型PMPAM水溶液及交联后的PNIPAM水凝胶呈现出温度敏感特性。其表现为在常温(25℃)以下，线性PNIPAM溶于水中形成均匀溶液，当水溶液温度升高至30一35℃之间的某一温度时(因合成方法、合成条件等而异)，溶液发生相变，表现出较低临界溶解温度(fower。riticalsolution temperature，简称LCST)，即pNIpAM水凝胶在常温(25℃)下呈溶胀状态，当其温度升高至相变点温度约32℃附近时，在温度变化数摄氏度就可以引发数倍甚至数十倍的体积收缩变化。
    由于PNIPAM对温度改变的响应性非常高，并且其LCST在犯℃左右，在PNIPAM中加人不同比例的交联剂时，LCST可以相应上移或下降。当带药PMPAM被注射人37℃左右的人体血管内时，体积会迅速变小，内载药物将以挤压方式迅速释放;在实际运用PMPAM作为磁性纳米药物载体时，应该设法控制其体积变化速度及程度，使其LCST在37℃左右，而且能缓慢收缩持续释放药物。用交联剂与线性PNIPAM交联后能很好的解决这个问题，即在PMPAM中加人不同比例的交联剂时，使LCST相应上移。我们采用的ADM一PMPAM一Fe3O4中已加人MBA作为交联剂，与PMPAM的交联率约为10%，其在20一50℃水溶液内，随着温度升高，体积收缩，动态光散射下观察其水凝胶的粒径在200-500 nm之间，并可在42℃左右大量释放ADM。正常人体肝脏温度为38℃左右，富血供的肝癌组织内温度与肝脏温度相仿;将 LCST为42℃左右的纳米微球ADM一PMPAM一Fe3O4引人至肿瘤血管内，利用PNIPAM的温度敏感特性，可在肿瘤血管内引起部分体积收缩，并以挤压方式释放药物，形成肿瘤内局部高浓度化疗药，提高治疗肿瘤的效果。在我们的实验中，C组为单纯动脉注人ADM一PMPAM组，肿瘤增大程度比B组(单纯灌注ADM组)小，可说明PMPAM的温度敏感特性有助于局部高浓度化疗药形成，使抗肿瘤作用增强，相比单纯灌注ADM抗肿瘤疗效好。如果能在加人磁场同时结合肿瘤局部升温至42℃左右，将可能达到更大的释药效果。
    从实验结果可以看出，用介人方法经肝动脉注人ADM一PNIPAM一Fe304，肿瘤区外加磁场组(D组)动物肿瘤生长最为缓慢，平均肿瘤体积明显小于其他各实验组。术后14d检测各组实验动物肺转移亦发现D组仅1只动物有肺转移，发生率明显低于其他各组。D组肺转移者转移瘤的数目也明显少于其他组，其中对照组A组肺转移瘤数目最多，可见单纯灌注化疗药对肿瘤治疗效果不如化疗加栓塞。ADM一PMPAM一Fe304进人肿瘤体内后，由于栓塞及化疗并行，肿瘤较快得到控制，减少了转移。
    本实验研究初步表明，经介人途径肝动脉灌注温度敏感性ADM一PNIPAM一Fe3O4同时在肿瘤区加磁场治疗肝脏肿瘤的方法可行，对兔VXZ肝移植性肿瘤生长有较好的抑制作用，且未出现异位栓塞症状及相关组织学发现。随着今后对其临床药理学、药动学等的深人研究和完善，ADM一PNIPAM一Fe3O4将有可能成为实体瘤的一种新型化疗栓塞剂。